Robust sammenligning af Protein niveauer på tværs af væv og udvikling ved hjælp af standardiserede kvantitative Western Blotting
Summary
I denne metode beskrives en robust og reproducerbar metode til sammenligning af protein niveauer i forskellige væv og på forskellige udviklingsmæssige timepoints ved hjælp af en standardiseret kvantitative western blotting tilgang.
Abstract
Western blotting er en teknik, der er almindeligt anvendt til at detektere og kvantificere protein udtryk. Gennem årene har denne teknik førte til mange fremskridt inden for både grundforskning og klinisk forskning. Som med mange lignende eksperimentelle teknikker, er resultatet af vestlige skamplet analyser, let påvirket af valg, der træffes i design og udførelse af forsøget. Specifikke husholdning proteiner har traditionelt været brugt til at normalisere protein niveauer for kvantificering, men disse har en række begrænsninger, og derfor er blevet kritiseret i stigende grad i de sidste par år. Her beskriver vi en detaljeret protokol, som vi har udviklet for at gøre det muligt at foretage komplekse sammenligninger af protein udtryk variation på tværs af forskellige væv, musemodeller (herunder sygdomsmodeller) og udviklingsmæssige timepoints. Ved hjælp af en fluorescerende total protein pletten og indføre brugen af en indre lastning standard, er det muligt at overvinde de nuværende begrænsninger i antallet af prøver, der kan sammenlignes i eksperimenter og systematisk sammenligne protein niveauer på tværs af en række forsøgsbetingelser. Denne tilgang udvider anvendelsen af traditionelle vestlige skamplet teknikker, hvorved forskere at bedre udforske protein udtryk på tværs af forskellige væv og prøver.
Introduction
Western blotting er en teknik, der er almindeligt anvendt til at detektere og kvantificere protein ytringsfrihed, herunder i væv homogeniseret eller ekstrakter. I år, har denne teknik ført til mange fremskridt inden for både grundforskning og klinisk forskning, hvor det kan bruges som et diagnostisk redskab til at identificere tilstedeværelsen af sygdom1,2. Western blotting blev første gang beskrevet i 1979 som en metode til at overføre proteiner fra polyacrylamidgeler nitrocellulose ark og derefter visualisere proteiner ved hjælp af sekundære antistoffer, der var enten radioaktivt mærket eller konjugeret til fluorescein eller peroxidase3. Gennem udviklingen af kommercielt tilgængelige kits og udstyr, er Western blotting metoder blevet stadig mere standardiseret og forenklet gennem årene. Ja, teknikken er nu let udført af forskere med forskellige baggrunde og niveauer af erfaring. Som med mange lignende eksperimentelle teknikker, er resultatet af vestlige skamplet analyser, let påvirket af valg, der træffes i design og udførelse af forsøget. Det er derfor vigtigt, at adgangen til standardiseret Western blotting metoder ikke tilsløre behovet for omhyggelig eksperimentelle planlægning og design. Eksperimentelle overvejelser omfatter, men er ikke begrænset til, eksempeldatabase forberedelse og håndtering, udvælgelse og validering af antistoffer til registrering af protein og gel til membran overførsel effektivitet af især små eller store ( 140 kDa) proteiner4,5,6,7,8,9. Protein kvalitet af den oprindelige prøve spiller en væsentlig rolle ved fastsættelsen af resultatet af den efterfølgende Western blot analyse. Som protein kan udvindes fra en bred vifte af prøver og kilder, herunder cellelinjer, væv fra dyremodeller og post mortem humane væv, er konsistens i håndtering og forarbejdning forpligtet til at opnå reproducerbare resultater. For eksempel, når langtidsopbevaring af prøver til protein udvinding er påkrævet, er det vigtigt at indse, at selv om protein er generelt stabilt på-80 ° C, forskelle i protein stabilitet mellem udvundne proteiner og intakt væv ved-80 ° C har været rapporterede10. Desuden, for at opnå reproducerbare estimater af protein mængder, konsekvent homogenisering af prøver er afgørende. Optimering af forskellige lysis buffere og homogenisering metoder (f.eks. manuel homogenisering sammenlignet med automatiserede metoder) kan være nødvendig før du starter en storstilet kvantitative eksperiment.
Normalisering strategier til at korrigere for protein lastning og kvantificering variation er afgørende for at opnå robuste, kvantitative resultater af protein udtryk. Husholdning proteiner som β-actin, har α-tubulin, β-tubulin og glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) traditionelt været brugt til at normalisere protein niveauer for kvantificering. Normalisering til specifikke husholdning proteiner til kvantificering formål er imidlertid blevet kritiseret i stigende grad over de sidste par år11,12. For eksempel kan udtryk for husholdning proteiner ændre på tværs af forskellige udviklingsstadier13,14, på tværs af væv fra de samme dyr4, og under forskellige sygdom betingelser4,15 ,16,17. Derfor begrænser brugen af specifikke husholdning proteiner mulighederne for at foretage mere komplekse sammenligninger mellem protein udtryk fra forskellige væv, på forskellige timepoints og under forskellige forsøgsbetingelser. Et alternativ til husholdning proteiner til kontrol for protein lastning variation er brugen af en total protein pletten (TPS) at etiketter og visualiserer alle proteiner til stede i en prøve. TPS giver signal normalisering baseret på total protein belastning i stedet niveauer af et specifikt protein og derfor kvantificering af TPS signal bør være sammenlignelige og reproducerbare uanset eksperimentelle tilstand, prøvetype eller udviklingsmæssige tidspunkt . Ponceau S, plet-fri geler, Coomassie R-350, Sypro-Ruby, Epicocconone, Amydo Black og Cy5 (gennemgik i ref. 18) er eksempler på total protein pletter. Hver af disse metoder har specifikke fordele og begrænsninger og valg af metode afhænger af tiden og værktøjer til rådighed samt eksperimentelle setup4,18.
Ud over at bruge en TPS for at korrigere for inden for membran lastning og kvantificering variabilitet, kan det være nødvendigt at sammenligne prøver mellem forskellige membraner, navnlig når du udfører omfattende protein udtryk analyse. Dog kan variabilitet i faktorer som antistof bindende effektivitet og total protein pletten intensitet indføre yderligere variabiliteten mellem protein prøver, der analyseres på separate geler og membraner. For robuste kvantificering i denne situation er det derfor nødvendigt at indføre en yderligere normalisering skridt at tage højde for mellem membran variabilitet. Dette kan opnås ved at inkludere en indre lastning standard på hver af separat analyseret membraner, der holdes konstant på tværs af eksperimenter. Denne standard kan tage form af et protein lysate, der kan fås i tilstrækkelige mængder til at bruges på tværs af alle membraner inkluderes i eksperimentet. Her bruger vi en lysate af mus hjernen (fremstillet af 5 dage gamle kontrol mus), som hjernen er let homogeniseret og opnåede proteinet lysate indeholder en betydelig mængde af protein i høj koncentration. Indlæsning af en intern standard i tre eksemplarer giver prøver på separate membraner til at blive normaliseret og sammenlignes direkte.
Her beskriver vi en detaljeret protokol, som vi har udviklet for at gøre det muligt at foretage komplekse sammenligninger af protein udtryk variation på tværs af forskellige væv, musemodeller (herunder sygdomsmodeller) og udviklingsmæssige timepoints19. Ved at kombinere en fluorescerende TPS med brug af en indre lastning standard, var vi i stand til at overvinde de nuværende begrænsninger i antallet af prøver og forsøgsbetingelser, som kan sammenlignes i et enkelt eksperiment. Denne tilgang udvider anvendelsen af traditionelle vestlige skamplet teknikker, hvorved forskere at bedre udforske protein udtryk på tværs af forskellige væv og prøver.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med de relevante eksperimentelle design, kontrolforanstaltninger og statistiske analyser, kan western blotting bruges til at foretage pålidelige kvantitative estimater af protein udtryk inden for og mellem et varieret udvalg af biologiske prøver. Den protokol, vi beskriver i det aktuelle manuskript har til formål at tjene som retningslinje for forskere søger for at bruge Western blotting for at foretage kvantitative analyse på tværs af større og mere komplekse grupper af prøver ved hjælp af en kombination af flu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.J.N.G. understøttes af Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z). Andre midler er blevet leveret af SMA Trust (SMA UK konsortium; T.H.G. & Y-T. H.), SMA Europa (T.H.G, D.v.D.H. & E.J.N.G.), universitetet i Edinburgh DTP i præcision medicin (T.H.G., ll & A.M.M.) og Euan MacDonald Forskningscenter for Motor neuronsygdomme sygdom (T.H.G).
Materials
| Fine Tipped Gel Loading Tips | Alpha Laboratories | GL20057SNTL | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL | ThermoFisher Scientific | 78437 | |
| Handheld homogeniser | VWR Collection | 431-0100 | |
| iBlot 2 Gel Transfer Device | ThermoFisher Scientific | IB21001 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size | ThermoFisher Scientific | IB401031 | |
| Image Studio Lite | Licor | N/A | Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/ |
| IRDye 800CW secondary antibodies | Licor | — | Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody. |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5800 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well | ThermoFisher Scientific | NP0323BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X) | ThermoFisher Scientific | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer | Licor | 927-40000 | |
| Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody | BD Transduction Laboratories | 610646 | Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number |
| REVERT Total Protein Stain, 250 mL | Licor | 926-11021 | |
| REVERT Wash Solution | Licor | 926-11012 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 |
Referências
- Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).
- Hutchinson, A. B., et al. Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV. Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, (2013).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PloS One. 8 (8), e72457 (2013).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
- Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).
- Smejkal, G., Gallagher, S. Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis. Biotechniques. 16 (2), (1994).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).
- Fosang, A. J., Colbran, R. J. Transparency Is the Key to Quality. Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
- Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions. Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).
- Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development. PloS One. 7 (8), e43028 (2012).
- Aghamaleky Sarvestany, A., et al. Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy. Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).
- Fuller, H. R., et al. Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).
- Liu, N. K., Xu, X. M. beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury. Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).
- Moritz, C. P. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Groen, E. J. N., et al. Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).
- Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
- Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges. Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).
- Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. . Applied longitudinal analysis. , (2004).
- Jordan, C. Y. Population sampling affects pseudoreplication. PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).
- LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP). Genes (Basel). 7 (12), (2016).
