Summary

Toxiciteitsstudie van zink oxide-nanodeeltjes in de celkweek en in Drosophila melanogaster

Published: September 19, 2019
doi:

Summary

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor het evalueren van de toxicologische profielen van zinkoxide nanodeeltjes (ZnO NPs) in het bijzonder, het type celdood in humane MRC5 Long fibroblasten en ROS vorming in de fruitvlieg Drosophila.

Abstract

Zinkoxide nanodeeltjes (ZnO NPs) hebben een breed scala aan toepassingen, maar het aantal rapporten over ZnO NP-geassocieerde toxiciteit is de afgelopen jaren snel gegroeid. Echter, studies die de onderliggende mechanismen voor ZnO NP-geïnduceerde toxiciteit verhelderden zijn scanty. We bepaalden de toxiciteits profielen van ZnO NPs met behulp van zowel in vitro als in vivo experimentele modellen. Een significante afname van de levensvatbaarheid van de cel werd waargenomen in ZnO NP-blootgestelde MRC5 Long fibroblasten, waaruit blijkt dat ZnO NPs cytotoxische effecten uitoefent. Evenzo, interessant, gut blootgesteld aan ZnO-NPs tentoongesteld een dramatische toename van reactieve zuurstof soorten niveaus (ROS) in de fruitvlieg Drosophila. Meer diepgaande studies zijn nodig om een risicobeoordeling voor het toegenomen gebruik van ZnO NPs door consumenten vast te stellen.

Introduction

Nanotechnologie verwijst naar de toepassing van nano-sized materialen die worden gebruikt in alle wetenschappelijke gebieden, met inbegrip van de geneeskunde, materialen wetenschap, en biochemie. Bijvoorbeeld, ZnO NPs die bekend staan om hun ultraviolet verstrooiing, chemische sensing, en anti-microbiële eigenschappen, evenals hoge elektrische geleidbaarheid, worden gebruikt in de productie van verschillende consumentenproducten zoals voedsel verpakking, cosmetica, textiel, rubbers, accu’s, katalysator voor de behandeling van auto-staart gassen, en biomedische-gerelateerde toepassingen1,2,3.

De ontluikende toepassingen van ZnO-producten op basis van NP, die leiden tot een toegenomen menselijke blootstelling aan ZnO NPs, hebben echter bezorgdheid geuit over hun potentiële nadelige gevolgen voor de menselijke gezondheid. Een aantal in vitro cellulaire studies hebben aangetoond dat ZnO NPs kan induceren oxidatieve stress, autophagy-gerelateerde cytotoxiciteit, ontsteking, en genotoxiciteit4,5,6,7,8 . Met name, de toxiciteit van ZnO NPs wordt verondersteld te worden veroorzaakt door de ontbinding van Zn tot vrije Zn2 + ionen, evenals de oppervlakte reactiviteit van ZnO, resulterend in de cellulaire Ionische en metabole onevenwichtigheden die zijn gekoppeld aan verminderde Ionische homeostase en een remming van Ion transport4,7,9,10. Belangrijk, studies hebben aangetoond dat de generatie van reactieve zuurstof soorten (ROS) is een van de primaire mechanismen onderliggende ZnO NPs-geassocieerde toxiciteit. Onvoldoende anti-oxidatieve activiteit na ROS-belediging is aangetoond dat zij verantwoordelijk zijn voor het opwekken van de cytotoxiciteit en DNA-schade9. De toxische effecten van ZnO NPs zijn ook gerapporteerd in diermodellen, waaronder knaagdieren1, zebravis11,12, evenals de ongewerveld Drosophila13.

Drosophila fungeert als een goed opgezet alternatief diermodel voor toxiciteits screening van chemische entiteiten en nanomaterialen (nm’s)14,15. Belangrijk is dat er een hoge mate van genetische en fysiologische gelijkenis bestaat tussen humaan en Drosophila die het gebruik van Drosophila rechtvaardigt als een in vivo model voor het evalueren van biologische reacties op milieuverontreinigingen zoals nm’s 16. Bovendien zijn er veel voordelen van het gebruik van Drosophila vanwege zijn geringe omvang, korte levensduur, genetische geschiktheid en eenvoudig en kosteneffectief onderhoud. Bovendien is Drosophila op grote schaal goedgekeurd voor de studie van genetica, moleculaire en ontwikkelingsbiologie, sinds zijn volledige genoom jaren geleden volledig is gesequenced terug in 2000, waardoor het geschikt is voor een verscheidenheid aan hoge doorvoer screening en voor het aanpakken van onopgeloste biologische vragen17,18,19,20,21. In de afgelopen jaren zijn een aantal studies gerelateerd aan immunotoxiciteit met behulp van verschillende soorten NPs in Drosophila gemeld15,22,23,24. Deze fundamentele nieuwe kennis verkregen uit de studies met Drosophila heeft geholpen om meer inzicht te geven in ons begrip van nano toxicologie.

ROS is een bekende boosdoener voor cytotoxiciteit en genotoxiciteit veroorzaakt door NPs, in het bijzonder, op metaal gebaseerde NPs25. ROS zijn zuurstof bevattende chemische soorten met hogere reactieve eigenschappen dan moleculaire zuurstof. Vrije radicalen zoals superoxide radicaal (O2) en zelfs, niet-radicale moleculen zoals waterstofperoxide (H2O2) kunnen fungeren als Ros. Onder normale fysiologische aandoening, ze zijn vereist voor het handhaven van cellulaire homeostase26, echter, buitensporige Ros als gevolg van overproductie of disregulatie van de antioxidant afweersysteem kan oxidatieve stress veroorzaken, wat leidt tot schade aan eiwitten, lipiden en deoxyribonucleïnezuur (DNA)27. Bijvoorbeeld, als ROS niveaus toenemen en glutathion (GSH) niveau tegelijkertijd afneemt, verstoring van adenosinetrifosfaat (ATP) synthese plaatsvindt en lactaat dehydrogenase (LDH) niveau verhogingen in het medium, culmineren in celdood27.

Hier bieden we protocollen voor het uitvoeren van cellulaire en genetische analyses met behulp van gekweekte zoogdieren cellen en Drosophila om te bepalen van de mogelijke nadelige effecten van ZnO NPs. Een overzicht van de methode die wordt gebruikt voor de toxiciteitsstudie van ZnO NPs wordt weergegeven in Figuur 1.

Protocol

1. fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) analyse op levende/vaste cellen Sonicate ZnO NPs in suspensie voor 15 min. Bereid ZnO NPs in verschillende concentraties (bijv. 0, 10, 25, 50.100 en 200 μg/mL) met 1 mg/mL ZnO NP stockoplossing voor de behandeling van gekweekte cellen. Seed MRC5 menselijke Long fibroblasten (1 x 105 cellen/goed) op een 6-well cultuur plaat een dag van tevoren, en vervolgens behandelen de cellen met 2 ml ZnO NPs (in triplicates) voor 8 h, 16 h, en …

Representative Results

NP-blootgestelde cellen werden verwerkt met de celkleuringsreagens Kit, gevolgd door celsortering met behulp van Flowcytometrie. ZnO NP-behandelde cellen (onder, rechter paneel) vertonen een hoger percentage vroege (R3)/late apoptotische cellen (R6) dan controle cellen (R5, onder, linker paneel). Necrotische celdood wordt aangeduid met R4 (boven, rechter paneel) (Figuur 2). De resultaten van de FITC/Annexin V-test op ZnO NP-behandelde MRC-5-fibroblasten zijn …

Discussion

Om te beoordelen of ZnO NP apoptosis in MRC5 fibroblasten kan induceren, gebruiken we flow cytometrie om de cellen te onderscheiden van necrotische of apoptotische celdood. In normale levende cellen, fosfatidylserine (PS) is gelokaliseerd op de celmembraan. Als apoptosis optreedt, is PS transgelegen naar de extracellulaire bijsluiter van het plasma membraan, waardoor de binding van Annexin V gelabeld met fluoresceïne (FITC Annexin V)29. Aan de andere kant, de rood-fluorescerende propidium jodide …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De studie werd ondersteund door het subsidie nummer R706-000-043-490. De studie vertegenwoordigt niet de mening van de subsidie sponsor.

Materials

15% Methyl 4-Hydroxybenzoate Sigma Aldrich
4% Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Bacto Agar BD biosciences
cncCK6/TM3, Sb a gift from Dr. Kerppola T
cornmeal, glucose, yeast brewer Sigma Aldrich
CyAn ADP with Summit Software DAKO https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf
Dihydroethidium (Hydroethidine) Thermo Fisher Scientific D11347
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD biosciences 556547
Fluorescent microscope Olympus
Glucolin Supermarket
Image J software NIH
MRC5 human lung fibroblast ATCC CCL-171
Schneider’s Drosophila medium Thermo Fisher Scientific 21720-024
vectashield antifade mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO NIG-FLY
Zinc Oxide Nanoparticles Sigma Aldrich 721077 Refer Sheet 2

Referências

  1. Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
  2. Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).
  3. Colvin, V. L. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).
  4. De Angelis, I., et al. Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells. Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).
  5. Johnson, B. M., et al. Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death. Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).
  6. Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).
  7. Song, W., et al. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).
  8. Wahab, R., et al. ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).
  9. Namvar, F., et al. Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).
  10. Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).
  11. Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).
  12. Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
  13. Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model. Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).
  14. Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).
  15. Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).
  16. Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective. Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).
  17. Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
  18. Jennings, B. H. Drosophila – a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
  19. Adams, M. D., Sekelsky, J. J. From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).
  20. Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287, 2185-2195 (2000).
  21. Ong, C., et al. Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis. Scientific Reports. 6, (2016).
  22. Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model. Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).
  23. Barik, B. K., Mishra, M. Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly. Nanotoxicology. , 1-27 (2018).
  24. Jovanovic, B., et al. The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster – a 20 generation dietary exposure experiment. Scientific Reports. 8, (2018).
  25. Cao, Y. The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).
  26. Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).
  27. Akter, M., et al. A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives. Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).
  28. Vecchio, G. A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health. Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).
  29. Marino, G., Kroemer, G. Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure. Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).
  30. Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , (2011).
  31. Yazdani, M. Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro. Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).
  32. Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay. Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).
  33. Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. , (2013).
check_url/pt/59510?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Ng, C. T., Ong, C. N., Yu, L. E., Bay, B. H., Baeg, G. H. Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e59510, doi:10.3791/59510 (2019).

View Video