세포 배양 및 초파리 멜라노가스터에서 산화 아연 나노 입자의 독성 연구
Summary
우리는 특히 산화 아연 나노입자(ZnO NPs)의 독성학적 프로파일을 평가하기 위한 상세한 프로토콜을 설명하며, 특히 인간 MRC5 폐 섬유아세포에서의 세포 사멸 유형 및 과일 플라이 드로소필라에서의ROS 형성을 설명한다.
Abstract
산화 아연 나노 입자 (ZnO NPs)는 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있지만 ZnO NP 관련 독성에 대한 보고의 수는 최근 몇 년 동안 급속히 증가하고 있습니다. 그러나, ZnO NP 유도 독성에 대 한 기본 메커니즘을 해명 하는 연구는 부족. 우리는 시험관 내 및 생체 내 실험 모델을 모두 사용하여 ZnO NPs의 독성 프로파일을 결정했습니다. ZnO NP-노출된 MRC5 폐 섬유아세포에서 세포 생존력의 현저한 감소가 관찰되었으며, ZnO NPs가 세포 독성 효과를 발휘한다는 것을 보여준다. 유사하게, 흥미롭게도, ZnO NPs에 노출된 장은 과일 플라이 드로소필라에서반응성 산소 종 수준(ROS)의 극적인 증가를 나타냈다. 소비자에 의한 ZnO NP의 증가된 사용에 대한 위험 평가를 수립하기 위해서는 보다 심층적인 연구가 필요합니다.
Introduction
나노 기술은 의학, 재료 과학 및 생화학을 포함한 모든 과학 분야에서 사용되는 나노 크기의 재료의 응용을 말합니다. 예를 들어, 자외선 산란, 화학 적 감지 및 항균 특성뿐만 아니라 높은 전기 전도성으로 알려진 ZnO NPs는 식품 포장, 화장품, 섬유, 고무, 배터리, 자동차 꼬리 가스 처리용 촉매 및 생물 의학 관련 응용 분야1,2,3.
그러나, ZnO NP 기반 제품의 급성장 응용 프로그램, ZnO NP에 대 한 인간의 노출증가로 이어지는, 인간의 건강에 그들의 잠재적인 불리 한 영향에 대 한 우려를 제기 했다. 시험관 내 세포 내 연구의 숫자는 ZnO NPs 산화 스트레스를 유도할 수 있음을 입증했다, 자가 포식 관련 세포 독성, 염증, 및 유독성4,5,6,7,8 . 특히, ZnO NPs의 독성은Zn2+ 이온을 해방시키기 위해 Zn의 용해뿐만 아니라 ZnO의 표면 반응성에 의해 유발되는 것으로 추정되며, 이로 인해 세포 이온성 및 대사 불균형이 손상된 이온 성 항상성과 결합되어 이온 수송의 억제4,7,9,10. 중요한 것은, 연구 결과는 반응성 산소 종의 생성이 (ROS) ZnO NPs 관련 독성의 근본적인 기계장치 의 한개이다는 것을 보여주었습니다. ROS 모욕 에 따른 불충분한 항산화 활성은 세포 독성 및 DNA 손상을 유도하는 데 책임이 있는 것으로 나타났다9. ZnO NPs의 독성 효과는 또한 설치류1,제브라피시11,12,무척추 동물 초파리13을포함하는 동물 모델에서 보고되었다.
Drosophila는 화학 물질 및 나노 물질 (NMs)14,15의독성 스크리닝을 위한 잘 확립된 대체 동물 모델로서 역할을 한다. 중요한 것은, NMs와 같은 환경 오염물질에 대한 생물학적 반응을 평가하기 위한 생체 내 모델로 Drosophila의 사용을 정당화하는 인간과 초파리 사이의 유전적 및 생리적 유사성의 높은 수준이 있습니다. 16. 또한, 때문에 작은 크기, 짧은 수명, 유전 편의 성, 쉽고 비용 효율적인 유지 보수에 초파리를 사용하는 많은 장점이 있습니다. 더욱이, Drosophila는 유전학, 분자 및 발달 생물학의 연구 결과, 그것의 가득 차있는 게놈이 2000년에 다시 년 전에 완전히 연속된 이래로 널리 채택되었습니다, 그러므로 높은 처리량 검열의 다양한 을 위해 적당하 그리고 해결되지 않은 생물학적 질문을 해결하기 위해17,18,19,20,21. 최근에는 초파리에서 다양한 유형의 NPs를 이용한 면역독성에 관한 다수의 연구가15,22,23,24로보고되고 있다. Drosophila를 사용하여 연구 결과에서 얻은 이 근본적인 새로운 지식은 나노 독성학의 우리의 이해에 더 많은 통찰력을 제공하는 것을 도왔습니다.
ROS는 NPs, 특히 금속 계 NPs25에의한 세포 독성 및 유독성에 대한 잘 알려진 범인입니다. ROS는 분자 산소보다 반응성이 높은 산소 함유 화학 종입니다. 수퍼옥사이드 라디칼(O2-)과 같은 자유 라디칼은과산화수소(H2O2)와같은 비라디칼 분자도 ROS로서 작용할 수 있다. 정상적인 생리적 상태에서, 그들은 세포 항상성26을유지하는 데 필요합니다, 그러나, 과다 한 ROS 때문에 과다 한 ROS 과잉 생산 또는 항 산화 방어 시스템의 dysregulation 산화 스트레스를 일으킬 수 있습니다., 단백질에 손상을 선도 하 고, 지질 및 디옥시리보핵산(DNA)27. 예를 들어, ROS 수치가 증가하고 글루타티온(GSH) 수준이 수반적으로 감소함에 따라, 아데노신 삼인산(ATP) 합성의 중단이 일어나고 배지에서 젖산 탈수소효소(LDH) 수준이 증가하여 세포사멸(27)이절정에 달한다.
여기에서, 우리는 ZnO NPs의 잠재적인 역효과를 결정하기 위하여 배양된 포유류 세포 및 Drosophila를 사용하여 세포와 유전 분석을 능력을 발휘하기 위한 프로토콜을 제공합니다. ZnO NPs의 독성 연구에 사용되는 방법에 대한 개요는 그림 1에나와 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
ZnO NP가 MRC5 섬유아세포에서 세포사멸을 유도할 수 있는지 평가하기 위해, 우리는 유동 세포분석기를 사용하여 세포를 괴사 세포 또는 세포사멸과 구별합니다. 일반적인 살아있는 세포에서는, 포스파티딜세린 (PS)는 세포막에서 국한됩니다. 세포자멸이 발생하는 경우, PS는 혈장막의 세포외 리플렛으로 옮겨져, 플루오레세인(FITC Annexin V)으로 표지된 아넥신 V의 결합을허용한다(FITC…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 보조금 번호 R706-000-043-490에 의해 지원되었다. 이 연구는 보조금 스폰서의 견해를 나타내지 않습니다.
Materials
| 15% Methyl 4-Hydroxybenzoate | Sigma Aldrich | ||
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto Agar | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | a gift from Dr. Kerppola T | ||
| cornmeal, glucose, yeast brewer | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP with Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD biosciences | 556547 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | ||
| Glucolin | Supermarket | ||
| Image J software | NIH | ||
| MRC5 human lung fibroblast | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| Zinc Oxide Nanoparticles | Sigma Aldrich | 721077 | Refer Sheet 2 |
Referências
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