Studio di tossicità delle nanoparticelle di ossido di zinco nella coltura cellulare e nella drosophila melanogaster
Summary
Descriviamo un protocollo dettagliato per la valutazione dei profili tossicologici delle nanoparticelle di ossido di zinco (NO NP) in particolare, il tipo di morte cellulare nei fibroblasti polmonari MRC5 umani e la formazione di ROS nel farro della frutta Drosophila.
Abstract
Le nanoparticelle di ossido di zinco (NO NP) hanno un’ampia gamma di applicazioni, ma il numero di rapporti sulla tossicità associata a NP è cresciuto rapidamente negli ultimi anni. Tuttavia, gli studi che chiariscono i meccanismi sottostanti per la tossicità indotta da NP nO sono scarsi. Abbiamo determinato i profili di tossicità degli NP di nO utilizzando modelli sperimentali sia in vitro che in vivo. È stata osservata una significativa diminuzione della vitalità cellulare nei fibroblasti polmonari MRC5 esposti da NP, dimostrando che le NP di NO esercitano effetti citotossici. Allo stesso modo, è interessante notare che l’intestino esposto alle NP di NP ha mostrato un drammatico aumento dei livelli di specie reattive dell’ossigeno (ROS) nel moscerino della frutta Drosophila. Sono necessari studi più approfonditi per stabilire una valutazione del rischio per l’aumento dell’utilizzo da parte degli NP di NO da parte dei consumatori.
Introduction
La nanotecnologia si riferisce all’applicazione di materiali di dimensioni nanometriche che vengono utilizzati in tutti i campi scientifici, tra cui la medicina, la scienza dei materiali e la biochimica. Ad esempio, gli NP nO, noti per la loro dispersione ultravioletta, il rilevamento chimico e le proprietà antimicrobiche, nonché l’elevata conduttività elettrica, sono utilizzati nella produzione di vari prodotti di consumo come imballaggi alimentari, cosmetici, tessuti, gomme, batterie, catalizzatore per il trattamento del gas coda di automobili e applicazioni biomediche1,2,3.
Tuttavia, le fiorenti applicazioni dei prodotti basati su NP di NO, che hanno portato ad una maggiore esposizione umana alle NP di NO, hanno sollevato preoccupazioni sui loro potenziali effetti negativi sulla salute umana. Una serie di studi cellulari in vitro hanno dimostrato che nO NP può indurre stress ossidativo, citobilsia autofagia, infiammazione, e genotossicità4,5,6,7 . In particolare, si presume che la tossicità degli NP di NP sia causata dalla dissoluzione di n2 o 2 o più ioni, nonché dalla reattività superficiale di inibizione del trasporto iosilio4,7,9,10. È importante sottolineare che gli studi hanno dimostrato che la generazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) è uno dei meccanismi primari alla base della tossicità associata a NPs. È stato dimostrato che un’insufficiente attività antiossidante a seguito di un insulto AL ROS è stato dimostrato di essere responsabile di suscitare la citotossicità e il danno al DNA9. Gli effetti tossici delle NP di NO sono stati riportati anche in modelli animali, tra cui roditore1, pesce zebra11,12, così come l’invertebrato Drosophila13.
La Drosophila funge da modello animale alternativo consolidato per lo screening della tossicità di entità chimiche e nanomateriali (MN)14,15. È importante sottolineare che esistono alti livelli di somiglianza genetica e fisiologica tra l’uomo e la Drosophila che giustifica l’uso della Drosophila come modello in vivo per valutare le risposte biologiche ai contaminanti ambientali come le MMM 16. Inoltre, ci sono molti vantaggi dell’uso della Drosophila a causa delle sue piccole dimensioni, della sua breve durata, dell’amenabilità genetica e del mantenimento facile ed economico. Inoltre, la Drosophila è stata ampiamente adottata per lo studio della genetica, della biologia molecolare e dello sviluppo, sin da quando il suo genoma completo è stato completamente sequenziato anni fa nel 2000, rendendolo quindi adatto per una varietà di screening ad alto valore e per affrontare questioni biologiche irrisolte17,18,19,20,21. Negli ultimi anni, una serie di studi relativi all’immunotossicità utilizzando diversi tipi di NP in Drosophila sono stati segnalati15,22,23,24. Queste nuove conoscenze fondamentali ottenute dagli studi che utilizzano la Drosophila hanno contribuito a fornire maggiori informazioni sulla nostra comprensione della nanotossicologia.
ROS è un noto colpevole di citotossicità e genotossicità causata da NP, in particolare, NP a base metallica25. I ROS sono specie chimiche contenenti ossigeno con proprietà reattive più elevate rispetto all’ossigeno molecolare. I radicali liberi come il superossido radicale (O2–) e anche molecole non radicali come il perossido di idrogeno (H2O2)possono agire come ROS. In condizioni fisiologiche normali, sono tenuti a mantenere l’omeostasi cellulare26, tuttavia, un ROS eccessivo a causa della sovrapproduzione o della disregolazione del sistema di difesa antiossidante può causare stress ossidativo, che porta a danni alle proteine, lipidi e acido deossiribonucleico (DNA)27. Ad esempio, con l’aumento dei livelli di ROS e l’aumento del livello di glutathione (GSH) concomitante, l’interruzione della sintesi del triposfato di adenosina (ATP) avviene e il livello di dehydrogenasi in lattato (LDH) aumenta nel mezzo, culminando nella morte cellulare27.
Qui, forniamo protocolli per l’esecuzione di analisi cellulari e genetiche utilizzando cellule di mammiferi coltivati e Drosophila per determinare i potenziali effetti negativi delle NP nO. Nella figura 1è riportata una panoramica del metodo utilizzato per lo studio di tossicità degli NP nO.
Protocol
Representative Results
Discussion
Al fine di valutare se l’NP nO può indurre l’apoptosi nei fibroblasti MRC5, usiamo la citometria di flusso per distinguere le cellule dalla morte cellulare necrotica o apoptotica. Nelle cellule vive normali, la fosfatidilaselserina (PS) è localizzata nella membrana cellulare. Se si verifica l’apoptosi, PS viene traslocato al volantino extracellulare della membrana plasmatica, consentendo il legame dell’annessione V etichettata con fluoresceina (FITC Annexin V)29. D’altra parte, lo iodio propidio…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo studio è stato sostenuto dal numero di sovvenzione R706-000-043-490. Lo studio non rappresenta il parere dello sponsor della sovvenzione.
Materials
| 15% Methyl 4-Hydroxybenzoate | Sigma Aldrich | ||
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto Agar | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | a gift from Dr. Kerppola T | ||
| cornmeal, glucose, yeast brewer | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP with Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD biosciences | 556547 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | ||
| Glucolin | Supermarket | ||
| Image J software | NIH | ||
| MRC5 human lung fibroblast | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| Zinc Oxide Nanoparticles | Sigma Aldrich | 721077 | Refer Sheet 2 |
Referências
- Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
- Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).
- Colvin, V. L. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).
- De Angelis, I., et al. Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells. Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).
- Johnson, B. M., et al. Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death. Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).
- Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).
- Song, W., et al. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).
- Wahab, R., et al. ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).
- Namvar, F., et al. Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).
- Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).
- Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model. Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).
- Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).
- Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).
- Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective. Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).
- Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
- Jennings, B. H. Drosophila – a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
- Adams, M. D., Sekelsky, J. J. From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287, 2185-2195 (2000).
- Ong, C., et al. Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis. Scientific Reports. 6, (2016).
- Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model. Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).
- Barik, B. K., Mishra, M. Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly. Nanotoxicology. , 1-27 (2018).
- Jovanovic, B., et al. The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster – a 20 generation dietary exposure experiment. Scientific Reports. 8, (2018).
- Cao, Y. The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).
- Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).
- Akter, M., et al. A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives. Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).
- Vecchio, G. A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health. Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).
- Marino, G., Kroemer, G. Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure. Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).
- Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , (2011).
- Yazdani, M. Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro. Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).
- Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay. Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).
- Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. , (2013).
