Toxicitetsstudie av Zinkoxidnanopartiklar i cell kulturen och i Drosophila melanogaster
Summary
Vi beskriver ett detaljerat protokoll för att utvärdera de toxikologiska profilerna av zinkoxidnanopartiklar (ZnO NPs) i synnerhet, vilken typ av celldöd i human MRC5 lung fibroblaster och ROS formation i bananfluga Drosophila.
Abstract
Zinkoxid nanopartiklar (ZnO NPs) har ett brett spektrum av tillämpningar, men antalet rapporter om ZnO NP-associerad toxicitet har vuxit snabbt under de senaste åren. Emellertid, studier som belyser de bakomliggande mekanismerna för ZnO NP-inducerad toxicitet är knappare. Vi bestämde toxicitetsprofilerna för ZnO NPs med hjälp av både in vitro-och in vivo-experimentella modeller. En signifikant minskning av cellernas lönsamhet observerades i ZnO NP-exponerade MRC5 lung fibroblaster, visar att ZnO NPs utöva cytotoxiska effekter. Likaså, intressant, Gut utsätts för ZnO NPs uppvisade en dramatisk ökning av reaktiva syreradikaler (ROS) i bananfluga Drosophila. Mer djupgående studier krävs för att fastställa en riskbedömning för ökad användning av ZnO NPs av konsumenter.
Introduction
Nanoteknik hänvisar till tillämpningen av nanosized material som används inom alla vetenskapliga områden, inklusive medicin, materialvetenskap, och biokemi. Till exempel, ZnO NPs som är kända för sin ultraviolett spridning, kemisk avkänning, och antimikrobiella egenskaper, samt hög elektrisk ledningsförmåga, utnyttjas i produktionen av olika konsumentprodukter såsom livsmedelsförpackningar, kosmetika, textilier, gummi, batterier, katalysator för bil svans gasbehandling, och biomedicinsk-relaterade tillämpningar1,2,3.
Emellertid, den spirande tillämpningar av ZnO NP-baserade produkter, vilket leder till ökad mänsklig exponering för ZnO NPs, har väckt farhågor om deras potentiella negativa effekter på människors hälsa. Ett antal in vitro cellulära studier har visat att ZNO NPS kan framkalla oxidativ stress, autofagi-relaterad cytotoxicitet, inflammation, och genotoxicitet4,5,6,7,8 . Särskilt, toxiciteten av ZnO NPs antas vara orsakad av upplösningen av Zn till fri Zn2 + joner, liksom ytan reaktivitet av ZnO, vilket resulterar i cellulära joniska och metaboliska obalanser som är förknippade med nedsatt jonisk homeostas och en hämning av jontransporten4,7,9,10. Viktigt, studier har visat att generationen av reaktiva syreradikaler (ROS) är en av de primära mekanismerna bakom ZnO NPs-associerad toxicitet. Otillräcklig anti-oxidativ aktivitet efter ROS förolämpning har visat sig vara ansvarig för framkalla cytotoxicitet och DNA-skador9. De toxiska effekterna av ZNO NPS har också rapporterats i djurmodeller, inklusive gnagare1, zebrafiskar11,12, samt ryggradslösa djur Drosophila13.
Drosophila fungerar som en väletablerad alternativ djurmodell för toxicitet screening av kemiska enheter och nanomaterial (NMS)14,15. Viktigt är att det finns höga nivåer av genetisk och fysiologisk likhet mellan människa och Drosophila som motiverar användningen av Drosophila som en in vivo-modell för utvärdering av biologiska svar på miljöföroreningar som NMS 16. Dessutom finns det många fördelar med att använda Drosophila på grund av dess ringa storlek, korta livslängd, genetiska amenability, och enkelt och kostnadseffektivt underhåll. Dessutom har Drosophila blivit allmänt antagen för studiet av genetik, molekylär-och utvecklingsbiologi, ända sedan hela genomet var fullständigt sekvenserat år sedan tillbaka i 2000, vilket gör det lämpligt för en mängd olika högpresterande screening och för att ta itu med olösta biologiska frågor17,18,19,20,21. Under de senaste åren har ett antal studier relaterade till immuntoxicitet med olika typer av NPS i Drosophila rapporterats15,22,23,24. Denna grundläggande nya kunskap som erhållits genom studierna med hjälp av Drosophila har bidragit till att ge mer insikt i vår förståelse av nanotoxikologin.
ROS är en välkänd boven i dramat för cytotoxicitet och genotoxicitet orsakad av NPs, i synnerhet metallbaserade NPs25. ROS är syrehaltiga kemiska arter med högre reaktiva egenskaper än molekyl syre. Fria radikaler såsom superoxid radikal (O2–) och även, icke-radikala molekyler såsom väteperoxid (H2O2) kan fungera som ros. Under normala fysiologiska tillstånd, de är skyldiga att upprätthålla cellulära homeostas26, dock, överdriven ros på grund av överproduktion eller dysreglering av antioxidant försvar kan orsaka oxidativ stress, vilket leder till skador på proteiner, lipider och deoxyribonukleinsyra (DNA)27. Till exempel, som ROS nivåer öka och glutation (GSH) nivå minskar samtidigt, störningar av adenosintrifosfat (ATP) syntes sker och laktatdehydrogenas (LDH) nivå ökar i mediet, som kulminerar i celldöd27.
Här tillhandahåller vi protokoll för att utföra cellulära och genetiska analyser med hjälp av odlade däggdjursceller och Drosophila för att fastställa de potentiella negativa effekterna av ZNO NPS. En översikt över den metod som används för toxicitetsstudien av ZnO NPs visas i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att bedöma om ZnO NP kan inducera apoptos i MRC5 fibroblaster, använder vi flödescytometri för att särskilja cellerna från nekrotisk eller apoptotisk celldöd. I normala levande celler, Fosfatidylserin (PS) är lokaliserad på cellmembranet. Om apoptos inträffar, är PS transplacerad till den extracellulära broschyren av plasmamembranet, vilket gör att bindningen av Annexin V märkt med fluorescein (FITC Annexin V)29. Å andra sidan, den rödfluorescerande propidiumjodid jodid (PI), …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien stöddes av bidrags numret R706-000-043-490. Studien representerar inte bidrags sponsorns uppfattning.
Materials
| 15% Methyl 4-Hydroxybenzoate | Sigma Aldrich | ||
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto Agar | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | a gift from Dr. Kerppola T | ||
| cornmeal, glucose, yeast brewer | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP with Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD biosciences | 556547 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | ||
| Glucolin | Supermarket | ||
| Image J software | NIH | ||
| MRC5 human lung fibroblast | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| wild- type Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| Zinc Oxide Nanoparticles | Sigma Aldrich | 721077 | Refer Sheet 2 |
Referências
- Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
- Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).
- Colvin, V. L. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).
- De Angelis, I., et al. Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells. Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).
- Johnson, B. M., et al. Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death. Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).
- Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).
- Song, W., et al. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).
- Wahab, R., et al. ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).
- Namvar, F., et al. Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).
- Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).
- Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model. Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).
- Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).
- Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).
- Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective. Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).
- Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
- Jennings, B. H. Drosophila – a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
- Adams, M. D., Sekelsky, J. J. From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287, 2185-2195 (2000).
- Ong, C., et al. Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis. Scientific Reports. 6, (2016).
- Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model. Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).
- Barik, B. K., Mishra, M. Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly. Nanotoxicology. , 1-27 (2018).
- Jovanovic, B., et al. The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster – a 20 generation dietary exposure experiment. Scientific Reports. 8, (2018).
- Cao, Y. The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).
- Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).
- Akter, M., et al. A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives. Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).
- Vecchio, G. A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health. Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).
- Marino, G., Kroemer, G. Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure. Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).
- Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , (2011).
- Yazdani, M. Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro. Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).
- Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay. Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).
- Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. , (2013).
