Physiologische Rand-3D-Sphäroide für antineoplastisches Arzneimittel-Screening, um Krebs-Stammzellen gezielt anzusprechen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von vom Patienten abgeleiteten Sphäroiden und nachgelagerte Analysen, einschließlich Quantifizierung der Proliferation, Zytotoxizitätstests, Durchflusszytometrie, Immunfluoreszenzfärbung und konfokale Bildgebung, um Potenzial der Kandidaten als antineoplastische Therapeutika. Dieses Protokoll unterstützt Präzisionsmedizin mit der Identifizierung spezifischer Medikamente für jeden Patienten und das Krankheitsstadium.
Abstract
In diesem Protokoll beschreiben wir das Verfahren zur Erzeugung von Tumorsphäroiden innerhalb von 384 gut hängenden Tröpfchen, um ein Hochdurchsatzscreening von Krebstherapeutika in einer physiologisch repräsentativen Mikroumgebung zu ermöglichen. Wir skizzieren die Bildung von patientenabgeleiteten Krebsstammzellsphäroiden sowie die Manipulation dieser Sphäroide für eine gründliche Analyse nach medikamentöser Behandlung. Insbesondere beschreiben wir die Sammlung von Sphäroidmorphologie, Proliferation, Lebensfähigkeit, Arzneimitteltoxizität, Zellphänotyp und Zelllokalisierungsdaten. Dieses Protokoll konzentriert sich stark auf Analysetechniken, die leicht mit der 384-Well hängenden Tropfen-Plattform implementiert werden können, so dass es ideal für High-Through-Through-Drogen-Screening. Während wir die Bedeutung dieses Modells in der Eierstockkrebsforschung und der Krebsstammzellforschung betonen, ist die 384-Well-Plattform für die Erforschung anderer Krebsarten und Krankheitsmodelle zugänglich und erweitert den Nutzen der Plattform auf viele Bereiche. Durch die Verbesserung der Geschwindigkeit des personalisierten Arzneimittelscreenings und der Qualität der Screening-Ergebnisse durch leicht zu implementierende physiologisch repräsentative 3D-Kulturen wird diese Plattform bei der Entwicklung neuer Therapeutika und patientenspezifischer Behandlungsstrategien und haben daher weitreichende klinische Auswirkungen.
Introduction
Die weltweite krebsbedingte Sterblichkeit erreichte 2018 eine Zahl von 9,8 Millionen Todesfällen1, was die Notwendigkeit der Entwicklung verbesserter Therapeutika unterstreicht. Leider steigen die Kosten für die Entwicklung von Krebsmedikamenten, wobei die Entwicklung eines einzigen Medikaments, das etwa 650 Millionen US-Dollar kostet, darauf hinweist, dass verbesserte Strategien zur Entwicklung neuer Krebsmedikamente erforderlich sind. Krebsstammzellen (CSCs), die durch erhöhte Chemoresistenz gekennzeichnet sind3, die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und die Fähigkeit, neue Tumoren4 auszusäen, werden als verantwortlich für Tumorrezidiv4, Metastasierung5und Chemoresistenz4,6, die alle zur bösartigen Kapazität des Tumors und damit zur hohen Zahl von Todesopfern beitragen. Bei Eierstockkrebs, Diese Zellen werden in der bösartigen Aszites Flüssigkeit in der Peritonealhöhle angereichert gefunden, ein Zustand mit schlechten klinischen Ergebnissen verbunden1. Als Folge der bösartigen Fähigkeiten von CSCs wurde versucht, neue CSC-Medikamente zu entwickeln, die in Verbindung mit herkömmlichen Chemotherapien verwendet werden können. Es gibt mehrere Herausforderungen, die die Entwicklung von CSC-Targeting-Medikamenten begleiten, darunter: 1) Schwierigkeiten bei der Ausweitung und Aufrechterhaltung von CSCs in vitro; 2) Knappheit der Patientenproben; 3) physiologische Relevanz der Kulturplattform; und 4) Heterogenität der Arzneimittelempfindlichkeit zwischen Patienten. Dieses Protokoll beschreibt die Implementierung einer 3D-Kulturplattform mit hohem Durchsatz, die jede dieser Herausforderungen bewältigen kann. Insbesondere ermöglicht dieses System ein schnelles Arzneimittelscreening mit einer kleinen Anzahl von patientenabgeleiteten Ovarial-CSCs und ist für nachgelagerte Analysetechniken sehr gut geeignet. Unsere Plattform ist zwar ideal für die Untersuchung von Eierstockkrebs und CSCs, aber auch bei der Untersuchung anderer Krebsarten und differenzierter Zelltypen in komplexen 3D-Umgebungen.
Komplexe dreidimensionale (3D) Modelle sind entscheidend für die Untersuchung der Tumor-Mikroumgebung (TME), die eine 3D-Nische aus Krebszellen,nicht-krebsunterstützenden Zellen und extrazellulären Matrixproteinen (ECM) 4 ist. Diese 3D-Umgebung führt zu einer einzigartigen Zellmorphologie, Zellzell- und Zellmatrix-Wechselwirkungen, Zelldifferenzierung, Zellmigration, Zelldichte und Diffusionsgradienten im Vergleich zur traditionellen 2D-Zellkultur in vitro4. All diese Faktoren gipfeln in einer differenzierten Arzneimittelreaktion innerhalb von 3D-Kulturen, die eine erhöhte Arzneimittelresistenz und physiologische Relevanz aufweisen7,8. Aufgrund der Rolle des 3D-TME bei der CSC-Differenzierung und Chemoresistenz ist es wichtig, CSC-Targeting-Medikamente in physiologischen Mikroumgebungen zu überprüfen. Die Verbesserung der physiologischen Relevanz von CSC-Medikamentenscreening-Plattformen hat das Potenzial, patientenspezifische Arzneimittelscreenings, Arzneimittelentwicklung, Formulierung von Behandlungsstrategien und letztlich klinische Ergebnisse zu verbessern. Ebenso wichtig ist es, dass die für das Arzneimittelscreening verwendete Plattform mit hohem Durchsatz und kompatibel mit nachgelagerten Analysemethoden ist, um Kosten, Zeit und klinische Übersetzungszeit vielversprechender Medikamente zu minimieren9.
Derzeit ist das komplexe TME am besten für Arzneimittel-Screening-Anwendungen durch In-vivo-Modelle wie murine syngene Tumormodelle, zelllinienabgeleitete Xenografts und patientenabgeleitete Xenograft-Modelle (PDX)12, da sie physiologische Bedingungen. Der niedrige Durchsatz dieser Modelle sowie die Kosten,-Zeit- und technischen Fähigkeiten, die sie benötigen, schränken jedoch ihren Nutzen in schnellen, hochdurchsatzstarken Arzneimittelscreening-Anwendungenein 13. Als Alternativen zu diesen In-vivo-Modellen verwenden viele In-vitro-3D-Modelle Hydrogele8, Kultur in mikrofluidischen Geräten oder “Organ-on-a-Chip”-Geräten10,14und nicht-anhantigische Kulturen3,8 wurden auch entwickelt, aufgrund ihrer geringen Eintrittsbarriere in Bezug auf Kosten, Zeit und erforderliche Fähigkeiten.
Hydrogelkulturplattformen sind vorteilhaft in der Feinkontrolle über die Matrixzusammensetzung, mechanische Eigenschaften und Matrixstruktur15; sie können jedoch die Zellkultur mit hoher Dichte hemmen14. Darüber hinaus kann die Ernte von Zellen aus Hydrogelen die nachgelagerte Analyse aufgrund potenziell schädlicher Auswirkungen der Erntemethoden erschweren15. Mikrofluidische Geräte hingegen sind Mikroskalige Geräte, die die Ausgangserkennung innerhalb desselben Geräts und für die Zellkultur in physiologisch relevanten Maßstäben mit minimalem Reagenzienverbrauch, verringerter Reaktionszeit, minimiertem Abfall und schnelle Diffusion14. Diese Eigenschaften machen sie vielversprechende Plattformen für die Untersuchung der Arzneimitteltoxizität, Wirksamkeit, und Pharmakokinetik. Die Herausforderungen einer effizienten, quantifizierbaren, reproduzierbaren und benutzerfreundlichen 3D-Zellkultur sowie sperriger und kostspieliger Pumpsysteme haben jedoch mikrofluidische Anwendungen in der Forschung mit hohem Durchsatz eingeschränkt10. Effiziente Erkennungseinstellungen und potenziell schwierige Implementierung enden über alle Bereiche hinweg haben auch die weit verbreitete Einführung mikrofluidischer Systeme behindert10.
Im Gegensatz dazu enthalten Sphäroide, die unter nicht haftenden Bedingungen in rotierenden Mischern (Nutatoren), ultraniedrigen Befestigungsplatten und hängenden Tröpfchen erzeugt werden, keine benutzerdefinierten Matrixkomponenten. Diese Methoden sind besonders relevant für die Untersuchung von Eierstockkrebs, da die nicht haftenden Bedingungen repräsentativ für die Bedingungen sind, unter denen Sphäroide innerhalb der Peritonealhöhle wachsen5. Innerhalb dieser nicht-haftenden Kulturmethoden haben Nutator- und hängende Tropfensphäroide gezeigt, dass sie eine höhere Verdichtung, Umgestaltung und Chemoresistenz im Vergleich zu Sphäroiden aufweisen, die in ultraniedrigen Befestigungsplatten erzeugt werden, was auf eine erhöhte physiologische Relevanz16,17,18,19. Aufgrund der erhöhten Kapazität für High-Throughput-Screening von kleineren Brunnengrößen und minimal erforderlichen Zellzahlen ist die Sphäroid-Generierung in hängenden Fallplatten eine ideale Plattform für das Drogenscreening. Hier präsentieren wir eine abstimmbare 3D-physiologische Plattform in 384 gut hängenden Fallplatten, die einfach zu implementieren ist und für nachgelagerte Analysen hochgradig zugänglich ist, was sie ideal für das Screening von Eierstockkrebs und Eierstock-CSCs mit hohem Durchsatz ermöglicht.
Unsere 3D-physiologische Plattform bietet alle Vorteile der 3D-Kultur, einschließlich physiologischer Zell-Zell-Kontakte, Diffusionsgradienten, Zelldichten und natürlich produzierten ECM-Proteinen, die zu realistischen Wirkstoffreaktionen beitragen können16, 17,18,19. Darüber hinaus sind wir durch die Erzeugung dieser Sphäroide mit patientenabgeleiteten CSCs in der Lage, patientenspezifische Reaktionen auf Medikamente1 mit vielen technischen Replikationen gleichzeitig zu bestimmen, um Heterogenität zu überwinden, die innerhalb des Patiententumors gefunden werden kann. Proben20. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die 3D-Kultur die Erhaltung der CSC-Populationen3,16 verbessert und somit repräsentativ für angereicherte CSC-Populationen in den Aszites7ist. Dies in Kombination mit einer einfachen nachgelagerten Analyse, einschließlich der Durchflusszytometrieanalyse der Lebensfähigkeit und cSC-Proportionen, ermöglicht eine optimale Bewertung der CSC-Targeting-Arzneimittelwirksamkeit. Schließlich ist diese physiologische Plattform mit der Bildgebung zu mehreren Zeitpunkten während des Experiments, der Bewertung von Zelltod und Zellproliferation, der Zellorganisation und Morphologie mit Immunhistochemie, der löslichen Signalisierung mit ELISA auf konditionierten Zellphänotypen mit Durchflusszytometrie und Genexpression nach PCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die 384-Well hängende Fallplatte plattform für die 3D-Sphäroidbildung ist ein leicht zu implementierendes Werkzeug für alle Zellbiologie- oder Krebsbiologielabore. Diese physiologische Plattform ermöglicht das Studium von Zelllinien sowie primären Patientenproben in physiologisch relevanten 3D-Kulturen und ermöglicht gleichzeitig ein Arzneimittelscreening mit hohem Durchsatz. Die Plattform stellt außerdem sicher, dass die Kulturbedingungen hochgradig abstimmbar sind, was eine enge Kontrolle über Beschichtungsdic…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird in erster Linie durch DOD OCRP Early Career Investigator Award W81XWH-13-1-0134(GM), DOD Pilot Award W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD Investigator Initiated Award W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), Rivkin Center for Ovarian Cancer und Michigan Ovarian Cancer unterstützt. Allianz. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Cancer Institute der National Institutes of Health unter der Nummer P30CA046592 unterstützt. CMN wird vom National Science Foundation Graduate Research Fellowship unter Grant No. 1256260 unterstützt. MEB wird vom Department of Education Graduate Assistance in Areas of National Need (GAANN) Fellowship unterstützt.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | ILT25200056 | |
| 10 mL serological pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 10,000 cSt Si oil | Millipore Sigma | 63148-62-9 | Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold. |
| 100 mm tissue culture dish | Thermo Scientific | 130182 | |
| 15 ml conical tube | Celltreat | FL4021 | |
| 1X DMEM for Serum Free Medium | Gibco | 11965-092 | |
| 1X F12 for Serum Free Medium | Gibco | 11765-054 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | ILT10010023 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | D1306 | |
| 40 µm filter | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies Inc. | 1449 | A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes. |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Scientific | A1049201 | |
| alamarBlue | Invitrogen | DAL1025 | Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent. |
| ALDEFLUOR assay kit | Stem Cell Tech | 1700 | Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer. |
| ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) | Stem Cell Tech | 1705 | Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining. |
| Andor iXon x3 CCD Camera | Oxford Instruments | – | |
| Antibiotics and Antimycotics | Gibco | 15240-062 | |
| APC-isotype IgG2b | Miltenyi biotec | 130-092-217 | Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor | Stem Cell Technologies | 78003.1 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| BioTek Synergy HT Microplate Reader | BioTek | 7091000 | |
| CD133-APC | Miltenyi biotec | 130-113-184 | Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker. |
| cellSens Dimension Software | Olympus | ||
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | P4394 | Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA. |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0311 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Life Technologies | AME3300 | |
| Fetal Bovine Serum – premium (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F4375 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining. |
| Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-5006 | |
| Human Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC2543 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium Supplement | Gibco | 51500-056 | |
| Live/Dead viability kit | Invitrogen | L3224 | Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1). |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| MetaMorph 7.8 Software | Molecular Devices | – | |
| Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope | Olympus | – | |
| Olympus IX83 Research Inverted Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M | Thomas Scientific | 7315D35 | Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange. |
| Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates | 3D Biomatrix | HDP1384-8 | Available through Sigma-Aldrich |
| phalloidin AlexaFluor488 | Invitrogen | A12379 | Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells. |
| ProJet 3500 HD Max | 3D Systems | – | 3D printer |
| Sterile DI water | Fisher Scientific | 353046 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15250061 | Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells. |
| VisiJet M3 Crystal | 3D Systems | – | A biocompatible polymer material for 3D printing. |
| Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | – |
Referências
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