Физиологические пациент выведенных 3D сфероидов для анти-неопластических наркотиков скрининга целевой рак стволовых клеток
Summary
Этот протокол описывает генерацию сфероидов, полученных из пациента, и анализ вниз по течению, включая количественную оценку пролиферации, тестирование цитотоксичности, цитометрию потока, оленивание иммунофлюоресценции и конфокальные изображения, для оценки препарата потенциал кандидатов в качестве анти-неопластической терапии. Этот протокол поддерживает прецизионную медицину с определением специфических препаратов для каждого пациента и стадии заболевания.
Abstract
В этом протоколе мы описываем процедуру генерации опухолевых сфероидов в 384-хорошо висячих каплях, чтобы обеспечить высокосквозной скрининг противораковой терапии в физиологически репрезентативной микросреде. Мы описываем формирование пациентов полученных сфероидов стволовых клеток, а также, манипуляции этих сфероидов для тщательного анализа после лечения наркотиками. В частности, мы описываем сбор сфероидной морфологии, пролиферации, жизнеспособности, токсичности наркотиков, фенотипа клеток и данных о локализации клеток. Этот протокол в значительной степени фокусируется на методах анализа, которые легко реализуются с помощью 384-хорошо висящей платформы drop, что делает его идеальным для скрининга с высокой пропускной проликстью наркотиков. Хотя мы подчеркиваем важность этой модели в исследованиях рака яичников и исследования стволовых клеток рака, 384-хорошо платформа поддается исследованию других типов рака и моделей заболеваний, расширяя полезность платформы во многих областях. Улучшая скорость персонализированного скрининга на наркотики и качество результатов скрининга за счет легко реализуемых физиологически репрезентативных 3D культур, эта платформа, по прогнозам, поможет в разработке новых терапевтических и специфических для пациентов стратегии лечения, и, таким образом, имеют широкое клиническое воздействие.
Introduction
Смертность от рака во всем мире достигла 9,8 миллионаслучаев смерти в 2018 году 1, что подчеркивает необходимость развития улучшенной терапии. К сожалению, стоимость разработки противораковых препаратов растет, при этом разработка одного лекарства стоимостью около 650 миллионов долларов США2 указывает на необходимость совершенствования стратегий разработки новых противораковых препаратов. Раковые стволовые клетки (CSCs), которые характеризуются повышенной химиорезистентности3, способность к самообновлению, и способность семян новыхопухолей4, как полагают, несет ответственность за рецидив опухоли4, метастаз 5 , и химиорезистентность4,6, которые все способствуют злокачественной способности опухоли и, следовательно, высокий уровень смертности. При раке яичников, эти клетки находятся обогащенные в злокачественных асцитов жидкости в полости перитонеальной полости, состояние, связанное с плохими клиническими исходами1. В результате злокачественных возможностей CSCs, наблюдается толчок к разработке новых CSC ориентации наркотиков для использования в сочетании с традиционной химиотерапии. Существует ряд проблем, которые сопровождают разработку CSC ориентации наркотиков, включая: 1) трудности в расширении и поддержании CSCs in vitro; 2) нехватка образцов пациентов; 3) физиологическая значимость культурной платформы; и 4) неоднородность в чувствительности к лекарственным препаратам между пациентами. В этом протоколе излагается реализация платформы 3D-культуры с высокой пропускной стоимостью, которая может преодолеть каждую из этих проблем. В частности, эта система позволяет быстро скрининг атиса с использованием небольшого числа пациентов полученных яичников CSCs, и в значительной степени поддается вниз по течению методов анализа. В то время как идеально подходит для изучения рака яичников и CSCs, наша платформа также ценна в изучении других видов рака и дифференцированных типов клеток в сложных 3D-средах.
Сложные 3-мерные (3D) модели имеют решающее значение при изучении микроокружения опухоли (TME), которая представляет собой 3D нишу, состоящую из раковых клеток, нераковых поддерживающих клеток и внеклеточных матричных (ECM) белков4. Эта 3D-среда приводит к уникальной морфологии клеток, клеток и клеточной матрицы взаимодействий, дифференциации клеток, миграции клеток, плотности клеток, и диффузии градиентов по сравнению с традиционной 2D-клеточной культуры в пробирке4. Все эти факторы кульминацией дифференциальной реакции наркотиков в 3D культур, проявляя повышенную лекарственную устойчивость и физиологическую актуальность7,8. В связи с ролью 3D TME в дифференциации CSC и химиорезности, очень важно, чтобы экран для CSC ориентации наркотиков в физиологических микросредах. Улучшение физиологической значимости платформ скрининга наркотиков CSC имеет потенциал для улучшения пациента конкретных скрининга наркотиков, разработка лекарственных средств, формулировка стратегий лечения, и в конечном итоге клинические результаты. Не менее важно, чтобы платформа, используемая для скрининга лекарственных средств, была высокой пропускной способом исовместима с методами анализа вниз по течению, чтобы свести к минимуму затраты, время и время клинического перевода перспективных препаратов 9.
В настоящее время комплекс TME лучше всего поддерживать для применения скрининга наркотиков через in vivo модели, такие как морин сингенных моделей опухолей, клеточной линии полученных ксенотрансплантатов, и пациента полученных ксенотрансплантата (PDX) модели12, как они обеспечивают физиологические Условия. Тем не менее, низкая пропускная стоимость этих моделей, а также, стоимость, время и технические навыки, которые они требуют ограничивает их полезность в быстрой, высокой пропускной стьюбиния наркотиков скрининга приложений13. В качестве альтернативы этим моделям in vivo, многие модели in vitro 3D, используя гидрогели8, культуры в микрофлюидных устройствах или устройствах “орган-на-чипе”10,14, и неприсоединения культур3,8 были также разработаны, в связи с их низким барьером для входа с точки зрения стоимости, времени и требуемого набора навыков.
Платформы культуры гидрогеля выгодны в тонком контроле, предоставляемом над матричной композицией, механическими свойствами и матричной структурой15; однако, они могут ингибировать культуру клетки высокой плотности14. Кроме того, сбор клеток из гидрогелей может осложнить анализ ниже по течению, из-за потенциально вредного воздействия методов сбора урожая15. Микрофлюидические устройства, с другой стороны, являются микромасштабными устройствами, которые позволяют обнаруживать выход в пределах одного устройства и для клеточной культуры в физиологически значимых масштабах с минимальным потреблением реагентов, снижением времени реакции, минимичными отходами и быстрая диффузия14. Эти характеристики делают их перспективными платформами для исследования токсичности, эффективности и фармакокинетики. Тем не менее, проблемы эффективной, количественной, воспроизводимой и удобной для пользователя 3D-клеточной культуры, а также громоздких и дорогостоящих насосных систем ограничили микрофлюидные приложения в высокопроизводительных исследованиях10. Эффективные установки обнаружения и потенциально трудное внедрение в различных областях также препятствуют широкому внедрению микрофлюидных систем10.
Напротив, сфероиды, генерируемые в неприсоединения в вращающихся смесителях (нутаторах), сверхнизких пластинах крепления и висячих каплях, не включают в себя матричные компоненты, определяемые пользователем. Эти методики особенно актуальны для изучения рака яичников, так как несоблюдение условий являются репрезентативными условий, в которых сфероиды растут в полости перитонеальной полости5. В рамках этих неприсоединения методы культуры, nutator и висит падение сфероидов было показано, чтобы показать более высокое уплотнение, ремоделирование, и химиорезистентность по сравнению с сфероидами, генерируемых в ультра-низких пластин вложения, предлагая увеличение физиологических актуальность16,17,18,19. Из-за увеличения емкости для высокопроизводительного скрининга от меньших размеров скважин и минимальных требуемых номеров клеток, генерация сфероидов в висячих пластинах является идеальной платформой для скрининга наркотиков. Здесь мы представляем настраиваем 3D физиологические платформы в 384-хорошо висит падение пластин, что легко реализовать и высоко поддается вниз по течению анализа, что делает его идеальным для высокой пропускной способности наркотиков скрининга рака яичников и яичников CSCs.
Наша 3D физиологическая платформа обеспечивает все преимущества 3D-культуры, в том числе физиологические контакты клеток, градиенты диффузии, плотность клеток, и естественно производства белков ECM, которые могут способствовать реалистичным лекарственным реакциям16, 17,18,19. Кроме того, генерируя эти сфероиды с помощью CSCs, полученных из пациента, мы можем определить конкретные реакции пациента на препараты1 с большим количеством технических реплик одновременно, чтобы преодолеть неоднородность, которая может быть найдена в опухоли пациента образцы20. Кроме того, 3D-культура была показана дляповышения поддержания популяций CSC 3,16 и, таким образом, является репрезентативным для обогащенных популяций CSC в ascites7. Это в сочетании с легким анализом вниз по течению, включая анализ цитометрии потока жизнеспособности и пропорций CSC позволяет оптимально оценивать эффективность CSC, нацеленную на эффективность препарата. Наконец, эта физиологичная платформа совместима с визуализацией в несколько точек времени в ходе эксперимента, оценкой гибели клеток и пролиферации, организацией клеток и морфологией с иммуногистохимией, растворимым сигнализирующим с ELISA на условии средние, клеточные фенотипы с цитометрией потока и экспрессией генов после ПЦР.
Protocol
Representative Results
Discussion
384-хорошо висит падение пластины платформы для 3D сфероидов формирования легко реализован инструмент для любой клеточной биологии или рака биологии лабораторий. Эта физиологическая платформа позволяет изучать клеточные линии, а также первичные образцы пациентов в физиологически знач…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается в первую очередь DOD OCRP Ранняя карьера Следователь премии W81XWH-13-1-0134 (GM), DOD Пилот награда W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD Следователь Инициированный награду W81XWH-17-OCRP-IIRA (GM), Ривкин Центр рака яичников и Мичигана яичников Альянс. Исследование, о которых сообщается в этой публикации, было поддержано Национальным институтом рака Национальных институтов здравоохранения под номером премии P30CA046592. CMN поддерживается Национальным научным фондом стипендий в соответствии с Грант Омской No 1256260. MEB поддерживается Департаментом образования аспирантуры в областях национальных потребностей (GAANN) стипендий.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | ILT25200056 | |
| 10 mL serological pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 10,000 cSt Si oil | Millipore Sigma | 63148-62-9 | Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold. |
| 100 mm tissue culture dish | Thermo Scientific | 130182 | |
| 15 ml conical tube | Celltreat | FL4021 | |
| 1X DMEM for Serum Free Medium | Gibco | 11965-092 | |
| 1X F12 for Serum Free Medium | Gibco | 11765-054 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | ILT10010023 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | D1306 | |
| 40 µm filter | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies Inc. | 1449 | A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes. |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Scientific | A1049201 | |
| alamarBlue | Invitrogen | DAL1025 | Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent. |
| ALDEFLUOR assay kit | Stem Cell Tech | 1700 | Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer. |
| ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) | Stem Cell Tech | 1705 | Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining. |
| Andor iXon x3 CCD Camera | Oxford Instruments | – | |
| Antibiotics and Antimycotics | Gibco | 15240-062 | |
| APC-isotype IgG2b | Miltenyi biotec | 130-092-217 | Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor | Stem Cell Technologies | 78003.1 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| BioTek Synergy HT Microplate Reader | BioTek | 7091000 | |
| CD133-APC | Miltenyi biotec | 130-113-184 | Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker. |
| cellSens Dimension Software | Olympus | ||
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | P4394 | Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA. |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0311 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Life Technologies | AME3300 | |
| Fetal Bovine Serum – premium (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F4375 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining. |
| Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-5006 | |
| Human Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC2543 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium Supplement | Gibco | 51500-056 | |
| Live/Dead viability kit | Invitrogen | L3224 | Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1). |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| MetaMorph 7.8 Software | Molecular Devices | – | |
| Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope | Olympus | – | |
| Olympus IX83 Research Inverted Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M | Thomas Scientific | 7315D35 | Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange. |
| Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates | 3D Biomatrix | HDP1384-8 | Available through Sigma-Aldrich |
| phalloidin AlexaFluor488 | Invitrogen | A12379 | Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells. |
| ProJet 3500 HD Max | 3D Systems | – | 3D printer |
| Sterile DI water | Fisher Scientific | 353046 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15250061 | Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells. |
| VisiJet M3 Crystal | 3D Systems | – | A biocompatible polymer material for 3D printing. |
| Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | – |
Referências
- . . All cancers Source: Globocan. , (2018).
- Prasad, V., Mailankody, S. Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval. JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575 (2017).
- Raghavan, S., et al. Personalized Medicine Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids. Clinical Cancer Research. 23 (22), 6934-6945 (2017).
- Jordan, C. T., Guzman, M. L., Noble, M. Cancer Stem Cells. New England Journal of Medicine. 355, 1253-1261 (2006).
- Ishiguro, T., et al. Establishment and Characterization of an In Vitro Model of Ovarian Cancer Stem-like Cells with an Enhanced Proliferative Capacity. Pesquisa do Câncer. 76, 150-160 (2016).
- Páez, D., et al. Cancer Dormancy: A Model of Early Dissemination and Late Cancer Recurrence. Clinical Cancer Research. 18, 645-653 (2012).
- Ahmed, N., Stenvers, K. L. Getting to Know Ovarian Cancer Ascites: Opportunities for Targeted Therapy-Based Translational Research. Frontiers in Oncology. 3, (2013).
- Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres. Biomaterials. 115, 141-154 (2017).
- Varna, M., Bertheau, P., Legrès, L. Tumor Microenvironment in Human Tumor Xenografted Mouse Models. Journal of Analytical Oncology. 3, 159-166 (2014).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: Effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays. Lab on a Chip. 13, 1133-1143 (2013).
- Zang, R., Li, D., Tang, I. C., Wang, J., Yang, S. T. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. , (2012).
- Murphy, B., et al. Evaluation of alternative in vivo drug screening methodology: a single mouse analysis. Pesquisa do Câncer. 76, 5798-5809 (2016).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived Xenograft models: An emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Damiati, S., Kompella, U. B., Damiati, S. A., Kodzius, R. Microfluidic devices for drug delivery systems and drug screening. Genes. 9, (2018).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A Practical Guide to Hydrogels for Cell Culture. Nature Methods. 14, 69-81 (2016).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Control Release. , (2012).
- Mehta, P., Novak, C., Raghavan, S., Ward, M., Mehta, G., Papaccio, G., Desiderio, V. Self-Renewal and CSCs In Vitro Enrichment: Growth as Floating Spheres. Cancer Stem Cells: Methods and Protocols. , 61-75 (2018).
- Raghavan, S., et al. Formation of stable small cell number three-dimensional ovarian cancer spheroids using hanging drop arrays for preclinical drug sensitivity assays. Gynecologic Oncology. 138, 181-189 (2015).
- Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7, 16948-16961 (2016).
- Kim, S., et al. Evaluating Tumor Evolution via Genomic Profiling of Individual Tumor Spheroids in a Malignant Ascites. Scientific Reports. 8, 1-11 (2018).
- Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Pesquisa do Câncer. 71, 3991-4001 (2011).
- Pulaski, H. L., et al. Identifying alemtuzumab as an anti-myeloid cell antiangiogenic therapy for the treatment of ovarian cancer. Journal of Translational Medicine. 7, 49 (2009).
- Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61, 78-84 (2016).
- Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D. Scientific Reports. 7, 41160 (2017).
