Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir
Summary
Bu protokol, ilacın belirlenmesi için, hastanın türetildiği kürlerin oluşumunu, proliferasyonun ölçülmesi, sitotoksisite testi, akış sitometri, immünofluoresesans boyama ve konfoksel görüntüleme gibi aşağı akış analizini açıklar. anti-neoplastik terapötik olarak adayların potansiyeli. Bu protokol her hasta ve hastalığın aşaması için spesifik ilaçların tanımlanması ile hassas ilacı destekler.
Abstract
Bu protokolde, biz 384 içinde tümör küreler nesil için prosedür anahat-iyi bir fizyolojik temsili mikroortamda anti-kanser terapileri yüksek verimlilik taraması için izin damlacıkları asılı. Biz hasta türetilmiş kanser kök hücre kürleri oluşumunu, yanı sıra, ilaç tedavisi sonrasında ayrıntılı analiz için bu kürlerin manipülasyon özetlemektedir. Özellikle, biz küroid morfoloji, proliferasyon, viability, ilaç toksisitesi, hücre fenotipi ve hücre yerelleştirme veri koleksiyonunu tarif. Bu protokol, 384-iyi asılı bırakma platformu kullanılarak kolayca uygulanan analiz tekniklerine odaklanarak yüksek verimlilik sağlayan ilaç taraması için idealdir. Biz yumurtalık kanser çalışmaları ve kanser kök hücre araştırma bu modelin önemini vurgulamak iken, 384-Well platformu diğer kanser türleri ve hastalık modelleri araştırma için, birçok alana platformun yarar uzanan imkan sağlar. Kişisel ilaç taramasının hızını ve kolayca uygulanan fizyolojik temsili 3D kültürlerle tarama sonuçlarının kalitesini geliştirerek, bu platform yeni terapötik ve hasta spesifik gelişimine yardımcı olmak için tahmin edilmektedir tedavi stratejileri ve böylece geniş kapsamlı klinik etkiye sahiptir.
Introduction
Dünya çapındaki kanserle ilgili mortalite, 20181‘ de 9.800.000 ölümlere ulaştı ve gelişmiş terapinin gelişmesine ihtiyacı vurgulandı. Ne yazık ki, kanser ilaçların geliştirilmesi maliyeti artmaktadır, tek bir ilacın gelişimi ile yaklaşık 650.000.000 USD2 yeni anti-kanser ilaçları geliştirmek için gelişmiş stratejiler ihtiyacını gösteren. Kanser kök hücreleri (CSCs), artan kemoresistans ile karakterize edilir3, kendini yenilemek için kapasite, ve yeni tümörler tohum yeteneği4 tümör nüks sorumlu olduğu düşünülmektedir4, metasür5, ve kemoterapi4,6, tüm tümör malign kapasitesine katkıda ve böylece yüksek ölüm ücreti. Yumurtalı kanserde, bu hücreler periton boşlukta malign asit sıvısında zenginleştirilmiş olarak bulunur, kötü klinik sonuçlar ile ilişkili bir durumdur1. CSCs ‘nin malign yetenekleri sonucunda, geleneksel kemoterapiler ile birlikte kullanılmak üzere yeni CSC hedefleme ilaçları geliştirmek için bir itme olmuştur. CSC hedefleyen ilaçların gelişimine eşlik eden çeşitli zorluklar vardır: 1) CSCs in vitro genişletilmesi ve bakımını yapma zorluk; 2) hasta örneklerinin kıtlık; 3) kültür platformunun fizyolojik alaka; ve 4) hastalar arasında ilaç hassasiyetinde heterojenlik. Bu protokol, bu zorlukların her birinin üstesinden gelebilmek için yüksek verimlilik sağlayan 3D kültür platformunun uygulanmasını özetliyor. Özellikle, bu sistem hasta türeyen ovaryalı CSCs az sayıda kullanarak hızlı ilaç taraması için izin verir, ve son derece aşağı akış analizi teknikleri için imkan sağlar. Yumurtalı kanserleri ve CSCs ‘leri incelemek için ideal olan platformumuz, karmaşık 3D ortamlarda diğer kanserleri ve farklılaşmış hücre tiplerini incelemek için de değerlidir.
Kompleks 3 boyutlu (3D) modeller, kanser hücrelerinden oluşan bir 3D niş olan tümör mikroortamının (TME), kanser olmayan destek hücrelerinden ve hücre dışı matriks (ECM) proteinleri4‘ ün incelenmesi açısından önemlidir. Bu 3D ortam, benzersiz hücre morfolojisi, hücre hücresi ve hücre matris etkileşimleri, hücre farklılaşma, hücre göçü, hücre yoğunluğu ve difüzyon degradelerinin geleneksel 2D hücre kültürüne göre in vitro4‘ e kıyasla sonuçlanır. Tüm bu faktörlerin 3D kültürler içinde diferansiyel ilaç tepkisi sonuçlanan, artan ilaç direnci ve fizyolojik alaka sergiler7,8. 3D TME ‘nin CSC farklılaşma ve kemoresistleşme rolü nedeniyle, fizyolojik mikroortamlarda CSC hedefleyen ilaçlar için ekran için hayati önem taşımaktadır. CSC ilaç tarama platformlarının fizyolojik alaka iyileştirilmesi hastanın spesifik ilaç taraması, ilaç gelişimi, tedavi stratejileri formülasyonu ve sonuçta klinik sonuçlar geliştirmek için potansiyele sahiptir. İlaç taraması için kullanılan platformun yüksek verim ve maliyet, zaman ve umut verici ilaçların klinik çeviri süresini en aza indirmek için aşağı akış analizi yöntemleri ile uyumlu olması aynı derecede önemlidir9.
Şu anda kompleks TME, fizin syngeneic tümör modelleri, hücre hattı tarafından türetilen xenograflar ve hasta tarafından türetilen xenograft (PDX) modelleri12gibi in vivo modellerde ilaç tarama uygulamaları için en iyi şekilde korunur, fizyolojik Koşul -ları. Ancak, bu modellerin düşük verim doğası, yanı sıra, maliyet, zaman, ve teknik beceri setleri hızlı, yüksek verimlilik ilaç tarama uygulamaları13onların yardımcı sınırları gerektirir. Bu in vivo modellerde alternatifler olarak, Hidrojeller8kullanan birçok in vitro 3D modelleri, mikroakışkan cihazlar içinde kültür veya ‘ organ-on-a-Chip ‘ cihazlar10,14ve olmayan-yapışmaz kültürler3,8 Ayrıca, maliyet, zaman ve gerekli skillset açısından giriş için düşük bariyer nedeniyle, geliştirilmiştir.
Hidrojel kültür platformları, matris bileşimi, mekanik özellikler ve matris yapısı15‘ te sağlanan ince kontrolde avantajlıdır; Ancak, yüksek yoğunluklu hücre kültürü inhibe edebilir14. Ayrıca, hidrojellerin gelen hasat hücreleri aşağı analiz karmaşıklığa neden olabilir, hasat yöntemlerinin potansiyel zararlı etkileri nedeniyle15. Mikrofluidik cihazlar, diğer taraftan, aynı cihaz içinde ve hücre kültürü için en az reaktif tüketimi ile fizyolojik olarak ilgili ölçeklerde çıkış algılaması için izin mikroölçekli cihazlar, azalma reaksiyon süresi, minimize atık ve hızlı difüzyon14. Bu özellikleri onları uyuşturucu toksisitesi, etkinliği ve farmakokinetiği araştırmak için umut verici platformlar olun. Ancak, verimli, ölçülebilir, reproducible ve Kullanıcı Dostu 3D hücre kültürünün zorlukları, hem de, hantal ve pahalı pompalama sistemleri yüksek verimlilik araştırma10mikrofluidik uygulamalar kısıtlı vardır. Verimli algılama kurulumları ve alanlarda potansiyel olarak zor uygulama da mikrofluidik sistemlerin yaygın benimsenmesini engelledi10.
Aksine, dönen mikserler (nutators), ultra-düşük ataşman plakaları ve asılı damlacıklar içinde olmayan-yapışmaz koşullarda oluşturulan küreler Kullanıcı tanımlı matris bileşenleri içermez. Bu metodolojiler özellikle yumurtalı kanserleri incelemek için ilgilidir, çünkü non-yapışkanlık koşullar, kürlerin periton kavite içinde büyümesini sağlayan koşulların temsilcisidir5. Bu olmayan-yapışmaz kültür yöntemleri içinde, nutator ve asılı damla küreler yüksek sıkıştırma sergiler gösterilmiştir, remodeling, ve kemoterapi Ultra düşük ataşman plakaları oluşturulan küreler karşılaştırıldığında, artan fizyolojik düşündürmektedir alaka16,17,18,19. Daha küçük iyi boyutlarda ve minimum gerekli hücre numaralarından yüksek verim taraması için artan kapasite nedeniyle, asılı damla plaklarda küroid üretimi ilaç taraması için ideal bir platformdur. Burada, 384 içinde ayarlanabilir bir 3D fizyolojik platform sunuyoruz-iyi asılı damla plakaları, bu uygulama kolay ve yüksek akış analizi için yüksek verim, yumurtalı kanser ve yumurtalı CSCs üst verimlilik ilaç taraması için ideal hale.
3D fizyolojik platformumuz, fizyolojik hücre-hücre kontakları, difüzyon degradeleri, hücre yoğunlukları ve doğal olarak üretilen ECM proteinleri dahil olmak üzere 3D kültürünün tüm avantajlarını sağlar ve bu da gerçekçi ilaç yanıtlarını16‘ ya katkıda bulunabilir, 17,18,19. Buna ek olarak, hasta türevi CSCs ile bu küreler oluşturarak, hasta tümör içinde bulunan heterojenlik üstesinden gelmek için, aynı anda birçok teknik çoğaltır ile ilaçlar1 hasta özel tepkiler belirlemek edebiliyoruz örnekleri20. Ayrıca, 3D kültür CSC nüfusu3,16 bakımını artırmak için gösterilmiştir ve böylece asit7zenginleştirilmiş CSC nüfus temsilcisi. Bu kolay akış analizi ile birlikte, canlılığı ve CSC oranlarında akış sitometri analizi de dahil olmak üzere CSC en iyi değerlendirme için ilaç etkinliğini hedefleme sağlar. Son olarak, bu fizyolojik platform, deney sırasında birden çok zaman noktasında görüntüleme, hücre ölümü ve proliferasyon, hücre organizasyonu ve immünhistokimya ile morfolojinin değerlendirilmesi, ELıSA ile çözünür sinyalizasyon ile uyumludur Orta, akış sitometri ile hücre fenotipleri, ve gen ifadesi aşağıdaki PCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D küroid oluşumu için 384-iyi asılı damla plaka platformu herhangi bir hücre biyoloji veya kanser biyoloji Labs için kolayca uygulanan bir araçtır. Bu fizyolojik platform, fiziksel olarak ilgili 3D kültürler içinde hücre hatları, yanı sıra, primer hasta örnekleri çalışma sağlar yüksek verim ilaç taraması için izin verirken. Platform ayrıca kültür koşullarının son derece ayarlanabilir olmasını sağlar, kaplama yoğunlukları üzerinde sıkı kontrol sağlayan, hücre Co-kültür oranları…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma öncelikle DOD OCRP erken kariyer araştırmacı Ödülü W81XWH-13-1-0134 (GM), DOD pilot Ödülü W81XWH-16-1-0426 (GM), DOD araştırmacı başlattı Ödülü W81XWH-17-OCRP-ıIRA (GM), Rivkin merkezi Ovarian kanser ve Michigan Ovarian kanser için desteklenmektedir Ittifak. Bu yayında rapor edilen araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından ödül numarası P30CA046592 altında destekleniyordu. CMN, 1256260 No ‘lu Grant altında Ulusal Bilim Vakfı lisansüstü araştırma bursu tarafından desteklenmektedir. MEB, Ulusal Ihtiyaç (GAANN) bursu alanlarında eğitim bölümü lisansüstü yardımı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | ILT25200056 | |
| 10 mL serological pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 10,000 cSt Si oil | Millipore Sigma | 63148-62-9 | Used to coat spheroid array mold to facilitate removal of tissue processing gels, like Histogel, from the mold. |
| 100 mm tissue culture dish | Thermo Scientific | 130182 | |
| 15 ml conical tube | Celltreat | FL4021 | |
| 1X DMEM for Serum Free Medium | Gibco | 11965-092 | |
| 1X F12 for Serum Free Medium | Gibco | 11765-054 | |
| 1X phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | ILT10010023 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | D1306 | |
| 40 µm filter | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 6-well plate | Fisher Scientific | 353046 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies Inc. | 1449 | A gentle cell detachment enzyme composed of proteolytic and collagenolytic enzymes. |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Scientific | A1049201 | |
| alamarBlue | Invitrogen | DAL1025 | Resazurin dye used to measure viability and proliferation of cells based on their ability to reduce resazurin to resorufin, which is highly fluorescent. |
| ALDEFLUOR assay kit | Stem Cell Tech | 1700 | Kit to identify stem and progenitor cells that express high levels of aldehyde dehydrogenase , an indicator of cancer stem cells. The kit is composed of ALDEFLUOR Reagent, DEAB, Hydrochloric Acid, Dimethylsulphoxide, and ALDEFLUOR Assay Buffer. |
| ALDEFLUOR Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) | Stem Cell Tech | 1705 | Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) is an inhibitor of ALDH isozymes, used to determine non-specific ALDH staining. |
| Andor iXon x3 CCD Camera | Oxford Instruments | – | |
| Antibiotics and Antimycotics | Gibco | 15240-062 | |
| APC-isotype IgG2b | Miltenyi biotec | 130-092-217 | Isotype control to quantify non-specific staining of IgG2b antibodies. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| basic Fibroblast Growth Factor | Stem Cell Technologies | 78003.1 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| BioTek Synergy HT Microplate Reader | BioTek | 7091000 | |
| CD133-APC | Miltenyi biotec | 130-113-184 | Fluorescent antibody targeting CD133, a cancer stem cell marker. |
| cellSens Dimension Software | Olympus | ||
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | P4394 | Platinum based chemotherapy agent that functions as an alkylating agent that disrupts DNA. |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| Epidermal Growth Factor | Gibco | PHG0311 | |
| EVOS XL Core Cell Imaging System | Life Technologies | AME3300 | |
| Fetal Bovine Serum – premium (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F4375 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Histogel | Thermo Scientific | HG-4000-012 | Tissue processing gel that can penetrate and hold the specimen within the gel while preventing discoloration around the specimen upon staining. |
| Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells | Lonza | PT-5006 | |
| Human Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC2543 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium Supplement | Gibco | 51500-056 | |
| Live/Dead viability kit | Invitrogen | L3224 | Kit for the fluorescence based detection of live (calcein-AM) and dead cells (Ethidium Homodimer-1). |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| MetaMorph 7.8 Software | Molecular Devices | – | |
| Olympus IX81 Inverted Confocal Microscope | Olympus | – | |
| Olympus IX83 Research Inverted Microscope | Olympus | ||
| Parafilm M | Thomas Scientific | 7315D35 | Thermoplastic polymer strips that serve to limit droplet evaporation in hanging drop plates while still allowing for gas exchange. |
| Perfecta 3D 384 Well Hanging Drop Plates | 3D Biomatrix | HDP1384-8 | Available through Sigma-Aldrich |
| phalloidin AlexaFluor488 | Invitrogen | A12379 | Phalloidin is a peptide to fluorescently label F-actin in fixed cells. |
| ProJet 3500 HD Max | 3D Systems | – | 3D printer |
| Sterile DI water | Fisher Scientific | 353046 | |
| Trypan Blue | Gibco | 15250061 | Azo dye used to differentiate between live and dead cells based on its ability to pass through the damaged membrane of dead cells, but not the intact membrane of live cells. |
| VisiJet M3 Crystal | 3D Systems | – | A biocompatible polymer material for 3D printing. |
| Yokogawa CSU-X1 Confocal Scanner Unit | Yokogawa | – |
Referências
- . . All cancers Source: Globocan. , (2018).
- Prasad, V., Mailankody, S. Research and Development Spending to Bring a Single Cancer Drug to Market and Revenues After Approval. JAMA Internal Medicine. 177, 1569-1575 (2017).
- Raghavan, S., et al. Personalized Medicine Based Approach to Model Patterns of Chemoresistance and Tumor Recurrence Using Ovarian Cancer Stem Cell Spheroids. Clinical Cancer Research. 23 (22), 6934-6945 (2017).
- Jordan, C. T., Guzman, M. L., Noble, M. Cancer Stem Cells. New England Journal of Medicine. 355, 1253-1261 (2006).
- Ishiguro, T., et al. Establishment and Characterization of an In Vitro Model of Ovarian Cancer Stem-like Cells with an Enhanced Proliferative Capacity. Pesquisa do Câncer. 76, 150-160 (2016).
- Páez, D., et al. Cancer Dormancy: A Model of Early Dissemination and Late Cancer Recurrence. Clinical Cancer Research. 18, 645-653 (2012).
- Ahmed, N., Stenvers, K. L. Getting to Know Ovarian Cancer Ascites: Opportunities for Targeted Therapy-Based Translational Research. Frontiers in Oncology. 3, (2013).
- Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres. Biomaterials. 115, 141-154 (2017).
- Varna, M., Bertheau, P., Legrès, L. Tumor Microenvironment in Human Tumor Xenografted Mouse Models. Journal of Analytical Oncology. 3, 159-166 (2014).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: Effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays. Lab on a Chip. 13, 1133-1143 (2013).
- Zang, R., Li, D., Tang, I. C., Wang, J., Yang, S. T. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. , (2012).
- Murphy, B., et al. Evaluation of alternative in vivo drug screening methodology: a single mouse analysis. Pesquisa do Câncer. 76, 5798-5809 (2016).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived Xenograft models: An emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Damiati, S., Kompella, U. B., Damiati, S. A., Kodzius, R. Microfluidic devices for drug delivery systems and drug screening. Genes. 9, (2018).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A Practical Guide to Hydrogels for Cell Culture. Nature Methods. 14, 69-81 (2016).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Control Release. , (2012).
- Mehta, P., Novak, C., Raghavan, S., Ward, M., Mehta, G., Papaccio, G., Desiderio, V. Self-Renewal and CSCs In Vitro Enrichment: Growth as Floating Spheres. Cancer Stem Cells: Methods and Protocols. , 61-75 (2018).
- Raghavan, S., et al. Formation of stable small cell number three-dimensional ovarian cancer spheroids using hanging drop arrays for preclinical drug sensitivity assays. Gynecologic Oncology. 138, 181-189 (2015).
- Raghavan, S., et al. Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity. Oncotarget. 7, 16948-16961 (2016).
- Kim, S., et al. Evaluating Tumor Evolution via Genomic Profiling of Individual Tumor Spheroids in a Malignant Ascites. Scientific Reports. 8, 1-11 (2018).
- Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Pesquisa do Câncer. 71, 3991-4001 (2011).
- Pulaski, H. L., et al. Identifying alemtuzumab as an anti-myeloid cell antiangiogenic therapy for the treatment of ovarian cancer. Journal of Translational Medicine. 7, 49 (2009).
- Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Advances in Medical Sciences. 61, 78-84 (2016).
- Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D. Scientific Reports. 7, 41160 (2017).
