Summary
Burada sunulan, CAS9-gRNA kompleksini omurilik merkezi kanalına enjekte ederek, akolotl spinal tellerinde zaman ve uzaya kısıtlı gen vuruş yapmak için bir protokoldür ve ardından Electroporation.
Abstract
Axolotl, omuriliği tamamen yeniden üretebilmek için eşsiz bir yetenektir. Bu büyük ölçüde, ependim tüp reform ve spinal kord yaralanmasından sonra kayıp nöronlar ayırt çoğalırlar yaşam boyunca nöral kök hücreleri (nscs) olarak kalan ependim hücreler kaynaklanmaktadır. Bu nscs 'nin pluripotkans sonrası gelişimini nasıl koruyacağı ve spinal kord yaralanması üzerine çoğalırlar tam ön yaralanma yapısının yeniden çözülmesi, memelinin spinal tellerinin nasıl rejenere olduğu ve potansiyel tedavi seçeneklerinin nasıl ortaya çıktığı konusunda değerli bilgiler sunabilir. Kısıtlı bir süre içinde nscs 'nin belirli alt kümelerinde gen çarpması gerçekleştirme, kalkınma müdahaleci etkileri ile şaşırtmadan bu rejeneratif süreçlerin arkasındaki moleküler mekanizmaların incelenmesi sağlayacaktır. Burada açıklanan, CRISPR-Cas9 sistemi kullanılarak Axolotl omurilik NSCs içinde gen knock-out gerçekleştirmek için bir yöntemdir. CAS9-gRNA kompleksini omurilik merkezi kanalına enjekte ederek, Elektroporasyon sonrasında, hedef genler, NSCs 'de omuriliğin belirli bölgelerinde istenen bir zaman noktasında yıkıldı, spinal kord NSCs 'de Moleküler çalışmalar için izin Rejenerasyon.
Introduction
Çoğu omurgasının omuriliği, kalıcı sakatlığa yol açan yaralanma sonrasında yeniden üretilemiyor. Axolotl gibi birçok Salamanders önemli istisnalar içindedir. Axolotl tamamen yapısal olarak özdeş bir omurilik yeniden üretebilir ve tamamen omurilik fonksiyonunu geri. Axolotl omurilik rejeneratif kapasitinin çoğunu ependim hücrelerden kaynaklanmaktadır. Bu hücreler merkezi kanalı hizalar ve memelilerin aksine, Axolotl ependim hücreler nöral kök hücreler (nscs) sonrası embriyonik gelişim olarak kalır. Omurilik yaralanması (örneğin, bir kuyruk amputasyonu) sonra, bu nscs ependim tüp regrow çoğalırlar ve kayıp nöronların yerine ayırt1,2,3. Axolotl omurilik NSCs 'lerin pluripotent olarak kaldığı ve yaralanma sonrasında aktif hale getirilmesinde, insan hastaları için yeni terapötik stratejiler geliştirme konusunda değerli bilgiler temin edilebilir.
Crispr-Cas9 gen knock-out tekniğinde yapılan ilerlemeler nedeniyle, deşifre gen fonksiyonunun çökmesini gerçekleştirmek daha kolay hale gelmiştir ve semenderlerin4,5 de dahil olmak üzere çeşitli türlerin geniş uygulanabilirliğini göstermiştir. 6 , 7 , 8. tam Axolotl genom ve transkriptom son sürümü şimdi herhangi bir genomik Locus hedeflenmesini sağlar ve off-hedef etkileri için daha iyi değerlendirmek için9,10,11,12 , 13 ' ü , 14. Crispr-Cas9 sistemi15kullanarak aksiyolotlar içinde knock-out ve knock-in için iyileştirilmiş protokoller geliştirilmiştir. Cas9 protein-Grna ribonukleoprotein (RNP) şeklinde Crispr-Cas9 makinenin teslimi, Cas9 ve Grna-kodlama plazmids4kullanarak daha verimli olduğu gösterilmiştir. Bu büyük olasılıkla RNP Plasmid vektörler daha küçük olması nedeniyle, onun yeteneği hemen DNA tatili oluşturmak ve RNA bozulması gRNA koruma. Buna ek olarak, RNPs kullanarak transkripsiyon ve çeviri atlar; Böylece, Plasmid elemanları farklı bir türden türetildiği zaman Organizatör gücü ve optimum kodon kullanımı gibi sorunları önler.
Fonksiyon kaybı çalışmaları, ilgi genlerinin potansiyel işlevlerini araştırmak için genel yaklaşımlardan biridir. Rejenerasyon sırasında gen fonksiyonunu incelemek için, bir vuruş ideal gelişim üzerindeki etkileri önlemek için bir yaralanma hemen önce yapılmalıdır. Ayrıca, knock-out hem NSCs hem de rejenerasyon bölgesi ile sınırlandırılmalıdır. Tüm NSCs 'deki hedef geni (CRE-LoxP sistemlerinde bulunan beyinde de dahil olmak üzere) bir vuruş, sonuçların yorumlanmasında bulunabilen rejenerasyona bağlı olmayan efektler üretebilir. Neyse ki, Axolotl omuriliğin yapısı NSCs 'de zaman ve boşluk kısıtlanması için benzersiz bir fırsat sağlar. Omurilik nscs çoğu merkezi kanal ile temas halinde ve merkezi kanal ile temas hücrelerin büyük çoğunluğu teşkil16,17. Bu nedenle, CAS9-Grna kompleksinin merkezi kanala enjekte edilmesi, ardından Elektroporasyon, belirli bir zamanda istenilen bölgede omurilik nscs 'ye teslim edilmesini sağlar4,18,19. Bu protokol, bunun nasıl gerçekleştirileceğini, hedeflenen omurilik NSCs 'de son derece penetran bir vuruş yapmaya neden olduğunu gösterir. daha sonra rejenerasyon ve NSC davranışı üzerindeki etkileri incelemek için sonraki analiz gerçekleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, Hayvan deneylerinde yerel ve ulusal düzenlemelere uygun olarak ve ilgili kurumsal İnceleme Kurulu onayı ile yapılmalıdır.
1. CAS9-gRNA RNP karışımı hazırlama
- GRNAs 'ı tasarlama ve sentezlemek.
Not: sadece semenderlerin15,20,21,22ile ilgili biri dahil olmak üzere grnas tasarlama ve synthesizer için diğer yayınlara bakın. - CAS9-NLS proteini ev içinde hazırlayarak veya ticari olarak satın alarak edinin.
- CAS9-gRNA karışımı 5 μg CAS9-NLS proteini, 4 μg gRNA, 0,9 μL 10X CAS9 tamponu karıştırarak hazırlayın ve hacmi 10 μL 'ye kadar doldurun-80 °C ' de hemen kullanılmamalıdır.
2. Elektroporasyon için agaroz plakaları hazırlama
- 1x dpbs 'de% 2 (WT/Vol) agaroz çözeltisi 200 ml hazırlayın. Bir mikrodalga içinde solüsyonu ısıtarak çözülür ve yaklaşık 10 mm derinliğe 10 cm Petri yemekleri üzerine dökün (tüm hayvanı kapsayacak kadar derin).
- Plakaların oda sıcaklığında katılaşma izni verin. Hemen kullanılmadı ise 4 °C ' de depo plakaları.
- Cerrahi neşter kullanarak, kuyruk düz tutmak için bir yarık yapmak için agaroz plaka kesme, hayvan gövdesinde uygun bir iyi, ve elektrotlar yerleştirmek için iki ekstra kuyular (Şekil 1E).
- Plakayı buzun üzerine yerleştirin ve buz gibi soğuk 1x DPBS ile doldurun. Ayarda tutarlı elektrik iletkenlik sağlamak için plakaları yapmak için aynı DPBS çözümünü kullanın.
3. elektroporator konfigürasyonu
- Elektroporatörü yapılandırın. 5 ms, 50 MS aralığı ve hiçbir voltaj çürüme süresi ile 70 V bir Bipolar nabız oluşur Poring darbe ayarlayın. 50 MS süresi, 999 MS aralığı ve% 10 voltaj çürümesi ile 40 V dört Bipolar darbe için transfer nabız ayarlayın.
- Elektrotları elektroporator 'a bağlayın ve cımbların 7 mm dışında olmasını ayarlayın. Elektroporasyon arasında önce ve içinde dpbs bir kabı elektrotlar Submerge.
4. mikroenjeksiyon cam kapillaries hazırlama ve yükleme
- Isı değerini belirlemek için üreticinin talimatlarına göre bir alev/kahverengi mikropipet çektirme üzerinde bir rampa testi gerçekleştirin.
- Aşağıdaki parametreleri kullanarak konik uçları ile enjeksiyon kapillaries çekin: ısı = rampa test değeri, çekme = 100, hız = 100, zaman = 100.
- Stereomikoskop altında iğne gözlemlemek. İnce forseps kullanarak, eğri bir ucu var, böylece kapiller bir açı kırın. Cilt delmek için yeterince güçlü iken, merkezi kanal hedeflemek için yeterince ince bir pozisyonda break.
Not: çapı yaklaşık 20 μm veya omurilik çapının yaklaşık% 50 olan nokta iyi bir başlangıç noktasıdır. Optimum kırma elde etmek için birden çok deneme gerekebilir. - 1:30 oranındaki RNP karışımlarına hızlı yeşil FCF solüsyonu ekleyin ve Microloader pipet ucu ile kapiller içine 5 μL enjeksiyon karışımı yükleyin.
- Pnömatik pompanın üzerine kapiller monte edin, eğimli ucu aşağı doğru bakacak şekilde.
5. Pnömatik pompanın yapılandırılması
- Pnömatik pompası yapılandırın. 0,5 inç kare başına pound (psi), 2 psi tutun ve süre Gated için çıkarmak için tutun ayarlayın.
- Kapiller bir damla su içine daldırma ve enjekte etmek için Ayak pedalına basarak kapiller ve pnömatik pompa ayarlarını test edin. Enjeksiyon karışımı yavaş ama sabit bir akışta çıkıyor emin olun.
- Enjeksiyon karışımı kendiliğinden sızmaya başlar veya su kapiller kadar emdi Eğer basılı tutun basıncı ayarlayın. Enjeksiyon karışımı çok yavaş çıkıyor Eğer ejeksiyon basıncı artırın veya kapiller daha fazla kırmak. Enjeksiyon çok hızlı çıkıyor Eğer ejeksiyon basıncı azaltın.
6. omurilik içine RNP karışımı enjekte
- % 0,03 Benzocain çözeltisi içinde en az 10 dk. içinde anestezize semenderlerin hayvanların su içinde ters onları saygısız tarafından duyarlı değildir kontrol edin.
- Yüzük forseps ile bir hayvan pick up ve silikon bir yatağa, hayvanın sol tarafı yukarı bakacak ve kuyruk sağa doğru işaret ile yatıyordu. Enjeksiyon alanını stereomikorkop görüş alanının ortasına konumlandırın (Şekil 1A).
- Mikromanipülatörü, kapiller görünüm alanının sağ tarafındaki 60 ° ' de gelecek şekilde ayarlayın (Şekil 1B).
- Omuriliği ve merkezi kanalı belirleyin (Şekil 1C).
Not: omurilik notoakor üzerinde tübüler yapısı. - Merkezi kanal hedefleyen, yavaşça omurilik merkezi kanala cilt ve kas delmek için kapiller ileriye taşıyın. Omurilik kuyruk kaslarının hemen altında olduğu için, kapiller hareketini küçük adımlarla sınırlandırın.
- Karışımı merkezi kanala enjekte etmek için ayak pedalını basılı tutun. RNP karışımı merkezi kanal boyunca her iki yönde mavi bir çizgi olarak yayılır olup olmadığını gözlemleyin, bu da kapiller doğru konumlandırılmış olduğunu gösterir (Şekil 1D).
- Bu gerçekleşmezse, RNP karışımı başlayana kadar kapiller hafifçe içeri ve dışarı hareket ettirirken ayak pedalını basılı tutun. Kapiller doku tarafından tıkanmış hale gelirse, yüksek basınçlarda suya fırlatarak temizleyin.
- Fırlatma basıncını, RNP karışımının merkezi kanalda yayılmasına neden olacak şekilde ayarlayın, ancak yapıyı havaya uçuracak kadar değil.
- İğne karışımı merkezi kanal boyunca daha da yayılır böylece ayak pedalı basılı tutmaya devam, beyin omurilik ve ventrikül sonunda Terminal vezikül ulaşır kadar.
Not: Bu, hayvanın boyutuna bağlı olarak 2 dakikaya kadar sürebilir. RNP karışımı beyin ventrikül girmek için neden bir süre sonra basıncı artırmak için gerekli olabilir. - Başarılı enjeksiyondan sonra Elektroporasyon mümkün olan en kısa sürede devam edin.
7. Elektroporasyon
- Hayvanları halka forseps ile hazırlanan agaroz Elektroporasyon plakasına (Şekil 1E) buz üzerinde aktarın. Kuyruğunu yarık içine yerleştirin, böylece agaroz (Şekil 1F) ile sandviç yapın.
- Elektrotları kuyruğun her iki tarafındaki kuyulara yerleştirin. Tüm hayvan ve elektrotlar buz-soğuk PBS ile kaplıdır emin olun.
- Electroporation başlatmak için ayak düğmesine basın.
- Elektroporasyon tamamlandıktan sonra, hayvan suya geri dönün.
- Gerekirse daha fazla hayvan enjekte etmeye devam edin.
- Anestezi kapalı giydikten sonra electroporated hayvanların sağlıklı olup olmadığını kontrol edin ve kuyruğuna yapılan herhangi bir hasar yoktur.
8. vuruş verimliliğini değerlendirmek
- Electroporated hayvanın kuyruğunu düzelt. Kuyruk çapraz bölümler yapmak immünohistokimyasal boyama tarafından takip protein düzeyinde knock-out verimliliğini değerlendirmek için.
Not: Eğer bir kuyruk amputasyonu Electroporation sonra gerçekleştirilecek ise, kesme kuyruğu bu amaçla kullanılabilir. GFP veya tyrosinase karşı gRNAs ile electroporated hayvanlar, Örneğin, negatif kontrol olarak kullanılabilir4. - Alternatif olarak, electroporated omurilik çıkarılan ve DNA için lysed olabilir. Düzenlenmiş genetik loci15yüzdesini değerlendirmek Için Sanger sıralamayı veya yeni nesil sıralamanın ardından Genotipleme PCR gerçekleştirin.
Not: sonuç düzenleme verimliliği nscs için gerçek düzenleme verimliliği hafife, non-electroporated hücrelerin ve merkezi lümene apikal temas eksikliği ve böylece RNP karışımı almazsınız nöronlar dahil nedeniyle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sox2 karşı CAS9-Grna kompleksinin enjeksiyonu ve electroporasyonu, Axolotl omurilik merkezi kanalına, spinal kord nscs çoğunluğu IÇINDE büyük Sox2 immünoreactivity kaybına yol açtı, Grna, Tyrosinaz (TYR) karşı bir kontrol olarak (Şekil 2 A). B3-tubulin (TUJ1 ile lekelenmiş), nöronlar için bir Işarettir ve nscs 'de ifade edilmedi ve merkezi kanalı çevreleyen SOX2-TUJ1-hücreler SOX2 silmeleri barındıran hücreler olarak kabul edildi. Miktarlama, CAS9-Sox2-Grna Elektroporasyon (Şekil 2B) tarafından çok sayıda nscs 'de Sox2 knock-out gösterdi, bu yöntemin omurilik nscs 'de verimli ve son derece penetran gen knock-out yaptığını gösteriyor.
Eşzamanlı enjeksiyon ve Elektroporasyon sonrasında, Sox2 ve Gfp 'ye karşı Iki CAS9-Grna kompleksinin karışımı, SıRASıYLA, her yerde Gfp ifadesi (caggs-Gfp) ile transjenik akolotlar içine, Çift knock-out nscs yüksek bir yüzdesi (Şekil 2C, D), protokol esnek knock-out birden fazla genler için kullanılabilir olduğunu gösteren görüldü.
Şekil 1 : Axolotl omurilik enjeksiyonu ve Elektroporasyon. (A) ŞEMATIK CAS9-GRNA RNP 'nin Axolotl omurilik merkezi kanalına enjekte edilmesini gösteriyor. (B) enjeksiyon için micromanipulator set-up. (C) Axolotl kuyruğunun stereomikoskop ile görünümü, omurilik ile gösterilir. (D) enjekte edilmiş bir omurilik ile Axolotl kuyruğunun mikroskoptan aracılığıyla görüntüleyin. (E) Elektroporasyon plakasının şematik. (F) Elektroporasyon plakasının içine yerleştirilen hayvan ve elektrotların şematiği. Ölçek çubukları = 1 mm. Bu rakam Albors ve Tanaka18' den uyarlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Akolotl omurilik NSCs temsilcisi vuruş sonuçları. (A) CAS9-Sox2-Grna (n = 21) omurilik enjeksiyonu ve electroporasyon immunohistokimyasal boyama ile 15 gün sonrası Elektroporasyon (DPE) nscs çoğunluğu Sox2 kaybına yol açtı. CAS9-Tyr-Grna (n = 21) negatif kontrol olarak hizmet vermiştir. Ölçek çubukları = 100 μm. (B) SOX2 + nscs 'de (p < 0,001, öğrenci t-testi tarafından) önemli oranda azalma GÖSTERDI, SOX2-TUJ1-merkezi kanalı çevreleyen hücreleri sayarak SOX2 silme işlemini yapan nscs. Hata çubukları = SD. (C) Sox2-Grna ve Gfp-Grna ile EŞZAMANLı enjeksiyon ve electroporasyon CAS9 (n = 6) ile birleştiğinde, nscs 'nin çoğunluğu IMMUNHISTOKIMYASAL lekeleme ile Sox2 ve Gfp kaybına yol açtı. CAS9-Tyr-Grna (n = 6) negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. Ölçek çubukları = 100 μm. (D) ölçüme göre, tüm hedeflenen nscs 'lerin herhangi bir silme, çoğunluk (% 94) arasında Sadece küçük bir oran (% 6) ile harbored çift silme (GFP − SOX2 −) tek silme (GFP + SOX-veya GFP-SOX2 +) sahip. Bu rakam Fei ve al.4' ten uyarlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Açıklanan protokol, Axolotl omuriliğinde NSCs 'de zaman ve uzaya kısıtlı gen çarpmasına olanak sağlar. Geçerli protokol, NSCs 'nin belirli bir zaman ve konumda yüksek penetrance ile belirli hedeflemesini sağlar. CRE-LoxP sistemini kullanırken ortaya çıkan beyin gibi diğer bölgelerde NSCs 'deki gen knock-out ' d a n kaynaklanan potansiyel istenmeyen efektleri önler. Aynı zamanda kalıcı bir knock-out kaynaklanan gelişimsel etkileri önler, gen fonksiyonu rejenerasyon odaklı çalışma izin. Buna ek olarak, bu protokol, CRE-LoxP sistemi için gerekli olan ek transjenik axolotls oluşturmak için gerekli uzun bekleme süresi kaçınarak, vahşi tip hayvanların gerçekleştirilebilir. Ayrıca, aynı anda çoklu genler knock-out çok yönlülük sunuyor ve son derece Penetran, deneyler F0 hayvanlar üzerinde gerçekleştirilmesine izin. Önemlisi, prosedür kuyruk ve omurilik rejenerasyonu üzerinde hiçbir gözlemlenebilir etkisi olduğunu gösterilmiştir4.
CAS9 protein-gRNA RNP kompleksler kullanımı da CAS9 ve Grna-ifade plazmids4kullanarak sistemlerden çok daha yüksek verimlilik gösterir. Bunun nedeni, Plazmidlere kıyasla RNP kompleksinin daha küçük boyutundan kaynaklandığıdır, aynı zamanda memeliler sistemlerinden elde edilen plasmidlerden CAS9 proteinin ifadesinin etkileyen diferansiyel kodon kullanımı. Buna ek olarak, CAS9 protein-gRNA RNP kompleksleri hemen tatili teşvik edebilir beri, knock-out hızlı bir şekilde oluşur. değiştirilmiş genomik loci% 60-% 70 Elektroporasyon (veri gösterilmez) 24 h içinde Genotipleme PCR tarafından gözlenmiştir. Ayrıca bir onarım şablonu Co-electroporating tarafından bu stratejisi kullanarak Knock-ins gerçekleştirmek için bir olasılık vardır. Bir dizi Knock-in stratejileri mevcuttur, Ayrıntılar ve hususlar Bu yayın için kapsam dışında olan, ancak başka bir yayın15ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Öte yandan, bu protokol birkaç sınırlamaları vardır. Boyama veya Genotipleme PCR genellikle zahmetli olabilir her deneysel hayvan, knock-out ölçüde değerlendirmek için gereklidir. Bu yöntemden gen knock-out büyük ölçüde merkezi kanal çevreleyen NSCs sınırlıdır ise, diğer hücre türleri de hedef olabilir, çünkü 1) onlar da merkezi kanal ile temas halinde, ya da 2) RNP karışımı dışarı sızdırmış olabilir şehir Electroporation önce Tral kanal. Bu faktörler sonuçları yorumlarken dikkate alınmalıdır.
gRNA tasarımı
Son zamanlarda yayımlanan Axolotl genom ve transcriptome ile Axolotl genler ve onların dizileri tanımlamak çok daha kolay hale gelmiştir9,10,11,12,13. Grnas tasarlamada ayrıntılı kılavuzlar, sadece semenderlerin15ile ilgili bir yer de dahil olmak üzere başka bir yerde tanımlanmıştır. Önceden düzenleme verimliliği için en az üç gRNAs tasarlayıp test etmek ve gerçek deney için optimum tasarımı seçmek tavsiye edilir. GRNA 'nın verimliliği, CAS9-gRNA karışımını tek hücreli aşama23' teki taze atılı Axolotl yumurtalarına enjekte ederek test edilebilir. Düzenleme verimliliği daha sonra yumurtadan larvaları Genotipleme tarafından değerlendirilebilir.
Enjeksiyon konuları
Omuriliğin enjeksiyon yeri, iğne ve RNP karışımının merkezi kanalın dışındaki dokulara yayılmasını neden olan fiziksel hasarlardan muzdaripten beri, incelenecek ilgi bölgesinden uzağa pozisyonlarda enjeksiyon yapmak önemlidir. Örneğin, omurilik rejenerasyonunda hedeflenen bir genin etkilerini incelemek için elektroporasyon sonrasında bir kuyruk amputasyonu gerçekleştirildiğinde, sitenin amputasyon ile çıkarılabileceği enjeksiyonu gerçekleştirmek gerekir.
Bir enjeksiyon kapiller ile merkezi kanala girmek bu protokol en kritik adımdır, ve yeni kullanıcılar gerçek deney önce pratik tavsiye edilir. Enjeksiyon en iyi küçük hayvanlar üzerinde gerçekleştirilir (az 2,5 cm uzunluğunda) omuriliğin posterior ucunda, nerede merkezi kanala kapiller ucu konumlandırmak için kolay. Mavi renkli RNP karışımın ilk yayılmasını yakından gözlemlemek tavsiye edilir. RNP karışımı omurilik çevresindeki meningeal uzaya enjekte edilebilir olasılığı vardır. Omuriliğin ortasında bir çizgi olarak keskin ve hızlı bir yayılma merkezi kanal18içine başarılı enjeksiyon gösterir. Eğer hiçbir şey çıkmazsa veya Spread zamanından önce durursa, kapiller hafifçe içeri ve dışarı hareket ettirirken ayak pedalının bastırılması önerilir. Bu başarısız olursa, kapiller veya tıkanmış bir açılış için kontrol yeniden konumlandırmak gerekli olabilir. RNP karışımı beyin ventrikül içine yaymak için, genellikle sonuna doğru ejeksiyon basıncı artırmak için gereklidir. Beyin ventriküllerin dolu olması omurganın Elektroporasyon için gerekli değildir, ama RNP karışımı merkezi kanala enjekte edildiğini en iyi göstergesidir.
Elektroporasyon hususları
Diğer dokulara geniş hasar vermeden veya hayvanı öldürmeden NSCs 'nin çoğunluğu için RNP 'ye yeterli teslimat elde etmek için elektroporasyon parametrelerini önceden optimize etmeniz tavsiye edilir. Bu protokol,18boyutunda 2.5 cm uzunluğundaki hayvanlar için optimize edilmiştir. 35 V 'ye transfer Pulse voltajında bir azalma, bundan daha küçük hayvanlarla çalışırken büyük olasılıkla gereklidir. Öte yandan, daha büyük hayvanlar daha yüksek voltaj ve/veya daha fazla bakliyat gerektirir. Buna ek olarak, elektrotlar arasındaki mesafe verimliliği etkiler. Daha büyük hayvanlar için 6 mm mesafenin azaltılması gerekebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor.
Acknowledgments
Prof. Elly M. Tanaka 'ya sürekli ve uzun vadeli destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma Çin 'in Ulusal Doğal Bilim Vakfı (NSFC) Grant (317716), Güney Çin normal Üniversitesi (S82111 ve 8S0109) ve bir Çin doktora sonrası Bilim Vakfı Grant (2018M633067) itibaren araştırma başlangıç hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
References
- O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
- Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
- Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).
- Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
- Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
- Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
- Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
- Fei, J. -F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
- Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
- Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).
- Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
- Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
