JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Murine appendectomie model van chronische colitis geassocieerde colorectale kanker door precieze lokalisatie van caecal patch

Published: August 24, 2019
doi:
10.3791/59921
, , , , , , , , ,
1Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital,Xi’an Jiaotong University, 2Institute of Medical Research,Northwestern Polytechnical University, 3School of Life Sciences,Northwestern Polytechnical University, 4Department of Medicine,Xi’an Jiaotong University, 5Princess Margaret Cancer Center,University of Health Network, 6Department of Pathology,Nanjing Medical University

Summary

Het gepresenteerde protocol beschrijft een facile chirurgische verwijdering van de appendix (caecal patch) in een muis gevolgd door de inductie van inflammatoire darmziekte-geassocieerde colorectale kanker. Dit Murine appendectomie model maakt onderzoek mogelijk naar de biologische rol van de appendix in de pathogenese van menselijke gastro-intestinale aandoeningen.

Abstract

De humane appendix is recentelijk betrokken bij het spelen van belangrijke biologische rollen in de pathogenese van verschillende complexe ziekten, zoals colorectale kanker, inflammatoire darmziekte, en de ziekte van Parkinson. Om de functie van het aanhangsel te bestuderen, is een met darmziekte geassocieerd muriene appendectomie-model vastgesteld en wordt het stapsgewijze protocol hier beschreven. Dit rapport introduceert een facile protocol voor het verwijderen van ileocaecale patch in muizen, gevolgd door de chemische inductie van chronische colitis-geassocieerde colorectale kanker met behulp van een combinatie van dextran sulfaat natrium (DSS) en azoxymethaan (AOM). IgA-specifieke cellen en IgA-concentratie werden significant verlaagd bij het verwijderen van de ileocaecale-pleister bij mannelijke C57BL/6-muizen in vergelijking met die in de Sham-groep. Gelijktijdige toediening van 2% DSS en AOM resulteerde in bijna 80% overleving van muizen in zowel Sham-als appendectomie groepen zonder significant lichaamsgewicht verlies. Histologische resultaten bevestigden Colon ontsteking en verschillende gradaties van adenocarcinoom. Dit model kan worden gebruikt voor de studie van de functionele rol van de Appendix bij het handhaven van gut microbiota homeostase en pathogenese van gut colitis en maligniteiten, evenals voor de potentiële ontwikkeling van drug targeting therapieën.

Introduction

De klinische appendectomie is een standaard chirurgische ingreep waarbij het aanhangsel wordt verwijderd, voornamelijk als gevolg van een ontsteking (bijv. appendicitis)1,2,3. De biologische functie van het wormvormig humane aanhangsel blijft echter controversieel4,5,6. De appendix wordt beschouwd als een overblijfsel van de blindedarm die uitstekt uit de blindedarm in de dikke darmen. Tot voor kort hebben evolutionaire, immunologische, morfologische en microbiologische studies gesuggereerd dat de appendix verschillende functies kan bezitten. Deze rollen omvatten de productie van bloed (bijv. Iga en IgG), een verscheidenheid aan B-cellen en T-cellen die kritisch zijn voor adaptieve immuunresponsen binnen de met de darm geassocieerde lymfoïde weefsels (galts), en de aanvulling van de dikke darm met commensale microbiotas 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12.

Klinisch epidemiologisch onderzoek bij patiënten met een voorafgaande appendectomie of acute blindedarmontsteking heeft ook zijn potentiële rol in de pathogenese van menselijke ziekten onthuld, zoals ontstekingsdarmziekte (IBD), colorectale kanker en niet-gastro-intestinale aandoeningen (bijv. de ziekte van Parkinson en hart-en vaatziekten)13,14,15,16,17,18. Bijvoorbeeld, een grote Aziatische populatie cohortstudie met 75.979 appendectomie patiënten toonde onlangs een significante associatie tussen appendectomie en latere ontwikkeling van colorectale kanker, een van de meest voorkomende maligniteiten met een hoge incidentie en sterfte14,19. Dienovereenkomstig zal het vaststellen van een geschikt dier appendectomie-model dat lijkt op een mens nuttig zijn om de biologische functies en moleculaire mechanismen van het aanhangsel bij de pathogenese van de ziekte te onderzoeken.

Veel zoogdieren bezitten een aanhangsel of aanhangsel-achtige orgel, met inbegrip van primaten, lagomorfen (bijvoorbeeld konijnen), sommige knaagdieren, en marsupien20. Voor kleine en veelgebruikte proefdieren bezit het konijn de vermiforme Appendix morfologisch gelijkend op de menselijke21,22, maar Galt in het konijn is extreem groot in vergelijking met die bij mensen, aangezien de meerderheid van lymfoïde weefsels zijn ook te vinden in Peyer’s patches gelegen in zowel kleine als grote darmen21. Daarnaast vertoont het konijn een verschillende lymfoïde Folliculaire structuur, T-celverdeling en immunoglobulindichtheid van de mens, wat het bestuderen van hun aanhangsels ongepast maakt21.

Muizen zijn het meest gebruikte diermodel om menselijke pathofysiologie te bestuderen en de verschillende bestaande en nieuwe therapuetics te testen23,24,25. De enkele witte grote lymfoïde cluster aan de Apex van het caecum in muizen, bekend als de ileocaecale patch, wordt verondersteld functies uit te voeren die vergelijkbaar zijn met de humane Appendix26,27,28. Toch is het praktisch moeilijk om de ileocaecale-pleister van caecum in muizen te scheiden. Tot nu toe hebben de gemeenschappelijke chirurgische procedures voor het induceren van blindedarmontsteking in een muismodel een relatief grote incisie (bijv. 1 – 2 cm) door de buikwand om toegang te krijgen tot het gehele caecum (aanvullende tabel 1)29, 30,31,32,33,34,35,36.

Hierin, voor het genereren van een appendectomie model geassocieerd met gastro-intestinale ziekten, dit verslag presenteert een faciele chirurgische protocol voor ileocaecale patch verwijdering in muizen. Dit wordt gevolgd door de gecombineerde toediening van de genotoxische agent AOM en pro-inflammatoire agent DSS voor de inductie van colitis-geassocieerde colorectale kanker vergelijkbaar met die gezien bij de mens. Er is aangetoond dat IBD een risicofactor is van darmkanker37,38. De combinatie van AOM/DSS-geïnduceerde chronische colitis-geassocieerde colorectale kanker is goed vastgesteld, en lezers kunnen verwijzen naar neufert et al., en thaker et al. voor gedetailleerde procedures39,40. Dit reproduceerbare en snelle Murine appendectomie model kan worden gebruikt voor de studie van aanhangsel-gemoduleerde darmontsteking en Colon microbiota, vooral in de ontwikkeling en progressie van IBD en colorectale kanker.

Protocol

Alle dier procedures werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Universiteit van Xi’an Jiaotong (nr. XJTULAC2019-1023). 1. muizen appendectomie Huis 8 – 10 weken oude C57BL/6 mannelijke muizen in een gecertificeerde specifieke-pathogeen vrije (SPF) omgeving voor 1 week voorafgaand aan de operatie. Bereid de volgende steriele chirurgische instrumenten voor: één paar micro-schaar, één paar micro-Tang, twee maten (4-0 en 8-0) van ges…

Representative Results

Oprichting van een Murine appendectomie model Dit Murine appendectomie model van chronische colitis geassocieerde colorectale kanker kan worden gegenereerd door het volgen van de sequentiële chirurgische en inductie stappen zoals geïllustreerd in Figuur 1. De meest frequente posities van caecum zijn in de linker en rechter iliacale Fossa gevolgd door de middelste lijn van de buik (Figuur 2). Het succesvolle tarief v…

Discussion

Een Murine appendectomie model van colitis-geassocieerde colorectale kanker werd verkregen met behulp van chirurgische stappen met een hoog overlevingspercentage bij muizen. In de meeste gevallen, omdat het caecum onder de buikwand werd geplaatst (aanvullende tabel 1, aanvullende tabel 2, en Figuur 2), was het moeilijk om de locatie te prebeoordelen zonder laparotomie. In dit chirurgische protocol werd een eenvoudige stap van het aanraken van de hobbel geïntroduceerd, en de…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door fundamentele onderzoeksfondsen voor de Centrale Universiteit (G2018KY0302), het universitair fundamenteel onderzoek van het Ontwikkelingsfonds (KT00062), de National Natural Science Foundation of China (81870380) en de Clinical Research Award van de Eerste aangesloten ziekenhuis van Xi’an Jiaotong University in China (nr. XJTU1AF-CRF-2015-029). De auteurs bedanken Dr. Chengxin Shi voor zijn technische suggesties tijdens de vroege exploratiefase van de Murine appendectomie model, evenals de patholoog Dr. XI Liu voor evaluatie van H & E kleuring resultaten van colitis en colorectale tumoren. Y.L. voerde de chirurgische demonstratie uit, deed gegevensanalyse en schreef het ontwerp van het manuscript; J.L., G.L., Z.P. en Y.M. namen deel aan de chirurgische voorbereiding, weefsel collecties en videoproductie; Hij voerde de flow cytometrie en ELISA uit; Q.W. page en H.X. op voorwaarde dat de technische ondersteuning van het genereren van een klinisch relevant Murine model; R.X.Z. ontwierp de studie, begeleidde het onderzoek en schreef en verzorgde het manuscript; J.S. heeft het manuscript bekeken.

Materials

Azoxymethane（AOM Sigma-Aldrich,Inc. A5486
Dextran Sulfate Sodium Salt（DSS MP Biomedicals,Inc. 160110
Entoiodine Shanghai likon high technology disinfection co. LTD 310102
digital caliper Ningbo yuanneng trading co. LTD 4859263
4-0 Silk Sutures Yuanlikang co. LTD 20172650032
8-0 Prolene Sutures Yuanlikang co. LTD 20172650032
Electric coagulation pen Chuang mei medical equipment co. LTD 28221777292
disposable syringe 1ml Shengguang medical products co. LTD 3262-2014
disposable syringe 10ml Shengguang medical products co. LTD 3262-2014
75% Medicinal alcohol Shandong anjie high-tech disinfection technology co. LTD 371402AAJ008
Pentobarbital sodium salt Sigma-Aldrich,Inc. 57-33-0
Physiological Saline Shandong qidu pharmaceutical co. LTD H37020766
Absorbent Cotton Swab Henan ruike medical co., LTD RK051
Surgical Instruments-Ophthalmic Jinzhong Shanghai co.LTD WA3050
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Leung, T. T., et al. Bowel obstruction following appendectomy: what is the true incidence. of Surgery. 250 (1), 51-53 (2009).
  2. Salminen, P., et al. Antibiotic Therapy vs. Appendectomy for Treatment of Uncomplicated Acute Appendicitis: The APPAC Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 313 (23), 2340-2348 (2015).
  3. Mayo Clinic. . Appendicitis. , (2019).
  4. . On the Appendix Vermiformis and the Evolution Hypothesis. Nature. 8, 509 (1873).
  5. Zahid, A. The vermiform appendix: not a useless organ. Journal of College of Physicians and Surgeons Pakistan. 14 (4), 256-258 (2004).
  6. Kooij, I. A., Sahami, S., Meijer, S. L., Buskens, C. J., Te Velde, ., A, A. The immunology of the vermiform appendix: a review of the literature. Clinical and Experimental Immunology. 186 (1), 1-9 (2016).
  7. Sarkar, A., Saha, A., Roy, S., Pathak, S., Mandal, S. A glimpse towards the vestigiality and fate of human vermiform appendix-a histomorphometric study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 9 (2), 11 (2015).
  8. Fujihashi, K., et al. Human Appendix B-Cells Naturally Express Receptors for and Respond to. Interleukin-6 with Selective Iga1 and Iga2 Synthesis. Journal of Clinical Investigations. 88 (1), 248-252 (1991).
  9. Im, G. Y., et al. The appendix may protect against Clostridium difficile recurrence. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9 (12), 1072-1077 (2011).
  10. Gebbers, J. O., Laissue, J. A. Bacterial translocation in the normal human appendix parallels the development of the local immune system. Annal of the New York Academy of Sciences. , 337-343 (2004).
  11. Randal Bollinger, ., Barbas, R., S, A., Bush, E. L., Lin, S. S., Parker, W. Biofilms in the large bowel suggest an apparent function of the human vermiform appendix. Journal of Theoretical Biology. 249 (4), 826-831 (2007).
  12. Smith, H., Parker, W., Kotzé, H., Laurin, S., M, Morphological evolution of the mammalian cecum and cecal appendix: Évolution morphologique de l’appendice du caecum des mammifères. Comptes Rendus Palevol. 16, (2017).
  13. Girard-Madoux, M. J. H., et al. The immunological functions of the Appendix: An example of redundancy. in Immunology. 36, 31-44 (2018).
  14. Wu, S. C., et al. Association between appendectomy and subsequent colorectal cancer development: an Asian population study. PLoS ONE. 10 (2), e0118411 (2015).
  15. Florin, T. H., Pandeya, N., Radford-Smith, G. L. Epidemiology of appendicectomy in primary sclerosing cholangitis and ulcerative colitis: its influence on the clinical behaviour of these diseases. Gut. 53 (7), 973-979 (2004).
  16. Arnbjornsson, E. Acute appendicitis as a sign of a colorectal carcinoma. Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 17-20 (1982).
  17. Killinger, B. A., et al. The vermiform appendix impacts the risk of developing Parkinson’s disease. Science Translatioanl Medicine. 10 (465), (2018).
  18. Chen, C. H., et al. Appendectomy increased the risk of ischemic heart disease. Journal of Surgical Research. 199 (2), 435-440 (2015).
  19. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  20. Smith, H. F., Parker, W., Kotze, S. H., Laurin, M. Multiple independent appearances of the cecal appendix in mammalian evolution and an investigation of related ecological and anatomical factors. Comptes Rendus Palevol. 12 (6), 339-354 (2013).
  21. Dasso, J. F., Obiakor, H., Bach, H., Anderson, A. O., Mage, R. G. A morphological and immunohistological study of the human and rabbit appendix for comparison with the avian bursa. Developmental and Comparative Immunology. 24 (8), 797-814 (2000).
  22. Smith, H. F., et al. Comparative anatomy and phylogenetic distribution of the mammalian cecal appendix. Journal of Evolutionary Biology. 22 (10), 1984-1999 (2009).
  23. Vandamme, T. F. Rodent models for human diseases. European Journal of Pharmacology. 759, 84-89 (2015).
  24. Prabhakar, S. Translational research challenges: finding the right animal models. Journal of Investigative Medicine. 60 (8), 1141-1146 (2012).
  25. Hosur, V., Low, B. E., Avery, C., Shultz, L. D., Wiles, M. V. Development of Humanized Mice in the Age of Genome Editing. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (10), 3043-3048 (2017).
  26. Mizoguchi, A., Mizoguchi, E., Chiba, C., Bhan, A. K. Role of appendix in the development of inflammatory bowel disease in TCR-alpha mutant mice. Journal of Experimental Medicine. 184 (2), 707-715 (1996).
  27. Farkas, S. A., et al. Preferential migration of CD62L cells into the appendix in mice with experimental chronic colitis. European Surgical Research. 37 (2), 115-122 (2005).
  28. Morrison, P. J., et al. Differential Requirements for IL-17A and IL-22 in Cecal versus Colonic Inflammation Induced by Helicobacter hepaticus. American Journal of Pathology. 185 (12), 3290-3303 (2015).
  29. Tomiyasu, N., et al. Appendectomy suppresses intestinal inflammation in a murine model of DSS-induced colitis through modulation of mucosal immune systems. Gastroenterology. 118 (4), A863-A863 (2000).
  30. Krieglstein, C. F., et al. Role of appendix and spleen in experimental colitis. Journal of Surgical Research. 101 (2), 166-175 (2001).
  31. Cheluvappa, R., Luo, A. S., Palmer, C., Grimm, M. C. Protective pathways against colitis mediated by appendicitis and appendectomy. Clinical and Experimental Immunology. 165 (3), 393-400 (2011).
  32. Cheluvappa, R., Luo, A. S., Grimm, M. C. T helper type 17 pathway suppression by appendicitis and appendectomy protects against colitis. Clinical and Experimental Immunology. 175 (2), 316-322 (2014).
  33. Masahata, K., et al. Generation of colonic IgA-secreting cells in the caecal patch. Nature Communications. 5, (2014).
  34. Cheluvappa, R. A novel model of appendicitis and appendectomy to investigate inflammatory bowel disease pathogenesis and remediation. Biological Procedures Online. 16, (2014).
  35. Cheluvappa, R., Eri, R., Luo, A. S., Grimm, M. C. Modulation of interferon activity-associated soluble molecules by appendicitis and appendectomy limits colitis-identification of novel anti-colitic targets. Journal of Interferon and Cytokine Research. 35 (2), 108-115 (2015).
  36. Harnoy, Y., et al. Effect of appendicectomy on colonic inflammation and neoplasia in experimental ulcerative colitis. British Journal of Surgery. 103 (11), 1530-1538 (2016).
  37. Aaron, E., Walfish, R. A. C. C. . Ulcerative Colitis. , (2017).
  38. Laukoetter, M. G., et al. Intestinal cancer risk in Crohn’s disease: a meta-analysis. Journal of Gastrointestestinal Surgery. 15 (4), 576-583 (2011).
  39. Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nature Protocols. 2 (8), 1998-2004 (2007).
  40. Thaker, A. I., Shaker, A., Rao, M. S., Ciorba, M. A. Modeling colitis-associated cancer with azoxymethane (AOM) and dextran sulfate sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. 10 (67), (2012).
  41. Perides, G., van Acker, G. J. D., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
  42. Schofield, W. B., Palm, N. W. Gut Microbiota: IgA Protects the Pioneers. Current Biology. 28 (18), R1117-R1119 (2018).
  43. Karthikeyan, V. S., et al. Carcinoma Cecum Presenting as Right Gluteal Abscess Through Inferior Lumbar Triangle Pathway-Report of a Rare Case. International Surgery. 99 (4), 371-373 (2014).
  44. Ruscelli, P., et al. Clinical signs of retroperitoneal abscess from colonic perforation Two case reports and literature review. Medicine (Baltimore). 97 (45), (2018).
  45. Friedman, G. D., Fireman, B. H. Appendectomy, appendicitis, and large bowel cancer). Pesquisa do Câncer. 50 (23), 7549-7551 (1990).
  46. Stellingwerf, M. E., et al. The risk of colectomy and colorectal cancer after appendectomy in patients with ulcerative colitis: a systematic review and meta-analysis. Journal of Crohn’s and Colitis. 13 (3), 309-318 (2018).

Tags

Murine AppendectomyCaecal PatchChronic ColitisColorectal CancerGastrointestinal DiseaseAppendix FunctionSurgical ProcedureMouse ModelCaecumAbdomen IncisionMesenteric Blood VesselsCaecal StumpSuture

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Li, Y., Liu, J., Liu, G., Pan, Z., Zhang, M., Ma, Y., Wei, Q., Xia, H., Zhang, R. X., She, J. Murine Appendectomy Model of Chronic Colitis Associated Colorectal Cancer by Precise Localization of Caecal Patch. J. Vis. Exp. (150), e59921, doi:10.3791/59921 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image