منصة زرع نخاع العظم للتحقيق في دور الخلايا التطبيب في مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف
Summary
مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف هو أحد المضاعفات الرئيسية بعد زرع نخاع العظم اللوجيني. تلعب الخلايا التطبيبية دورًا حاسمًا في الإمراض لمرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف. المادة الحالية يصف جديدة زرع نخاع العظم منصة للتحقيق في دور الخلايا التشجرات في تطوير مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف وتأثير الكسب غير المشروع مقابل سرطان الدم.
Abstract
زرع نخاع العظم الأوجيني (BMT) هو علاج فعال للأورام الدموية بسبب تأثير الكسب غير المشروع مقابل سرطان الدم (GVL) للقضاء على الأورام. ومع ذلك ، يقتصر تطبيقه على تطور مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف (GVHD) ، وهو أحد المضاعفات الرئيسية لـ BMT. يتم استحضار GVHD عندما الخلايا التائية في الطعوم المانحة الاعترافالوانتيجين التي تعبر عنها الخلايا المتلقية ويشن الهجمات المناعية غير المرغوب فيها ضد الأنسجة السليمة المتلقي. وهكذا، تم تصميم العلاجات التقليدية لقمع المتبرع T-خلية alloreactivity. ومع ذلك، فإن هذه النُهج تضعف إلى حد كبير تأثير GVL بحيث لا يتم تحسين بقاء المتلقي. وبالتالي فإن فهم آثار النهج العلاجية على BMT و GVL و GVHD أمر ضروري. بسبب قدرات التبذير وإفراز السيتوكين لتحفيز الخلايا التائية المانحة، تلعب الخلايا التطبيبة المتلقية (DCs) دورًا مهمًا في تحريض GVHD. ولذلك، يصبح استهداف البلدان النامية المتلقية نهجاً محتملاً للسيطرة على الـ GVHD. يقدم هذا العمل وصفاً لمنصة BMT جديدة للتحقيق في كيفية تنظيم البلدان النامية المضيفة لاستجابات GVH وGVL بعد الزرع. كما يقدم نموذج BMT فعال لدراسة بيولوجيا GVHD وGVL بعد الزرع.
Introduction
زرع الخلايا الجذعية الدموية الأنجينية (BMT) هو علاج فعال لعلاج الأورام الخبيثة الدموية1،2 من خلال تأثير الكسب غير المشروع مقابل سرطان الدم (GVL)3. ومع ذلك ، فإن الخلايا اللمفاوية المانحة دائما ً ما تشن هجمات مناعية غير مرغوب فيها ضد الأنسجة المتلقية ، وهي عملية تسمى مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف (GVHD)4.
نماذج المورين من GVHD هي أداة فعالة لدراسة بيولوجيا GVHD واستجابة GVL5. الفئران هي نموذج الحيوان البحوث فعالة من حيث التكلفة. فهي صغيرة وفعالة مبوئيمع الجزيئات والبيولوجية في المراحل المبكرة من التنمية6. الفئران هي الحيوانات البحثية المثالية لدراسات التلاعب الجيني لأنها محددة وراثيا، وهو مثالي لدراسة المسارات البيولوجية والآليات6. وقد تم العديد من الفأرة الرئيسية المعقدة histocompatibility (MHC) نماذج غير متطابقة من GVHD راسخة، مثل C57BL/6 (H2ب)إلى BALB/c (H2د)وFVB (H2 q)→C57BL/6q(H2ب)5،,7. هذه هي نماذج قيمة بشكل خاص لتحديد دور أنواع الخلايا الفردية والجينات والعوامل التي تؤثر على GVHD. زرع من C57/BL/6 (H2ب)المتبرعين الوالدين إلى المتلقين مع الطفرات في MHC I (B6.C-H2bm1)و / أو MHC الثاني (B6.C-H2bm12)كشفت أن عدم التطابق في كل من الفئة MHC الأول والفئة الثانية هو شرط مهم لتطوير GVHD الحادة. وهذا يشير إلى أن كل من CD4+ وCD8+ الخلايا التائية مطلوبة لتطوير المرض7،8. وتشارك GVHD أيضا في سلسلة التهابية تعرف باسم ‘عاصفة السيتوكين الموالية للالتهابات’9. طريقة التكييف الأكثر شيوعا في نماذج المورين هو تشعيع الجسم الكلي (TBI) عن طريق الأشعة السينية أو 137Cs. وهذا يؤدي إلى استئصال نخاع العظم للمتلقي، مما يسمح للمتبرع بتطعيم الخلايا الجذعية ومنع رفض الكسب غير المشروع. ويتم ذلك عن طريق الحد من انتشار الخلايا التائية المتلقية استجابة للخلايا المانحة. بالإضافة إلى ذلك ، تلعب التفاوتات الوراثية دورًا مهمًا في تحريض المرض ، والذي يعتمد أيضًا على MHC-mismatch81. لذلك ، تختلف جرعة التشعيع النقوي في سلالات الفئران المختلفة (على سبيل المثال ، BALB /c→ C57BL/6).
تنشيط الخلايا التائية المانحة من قبل مستضد المضيف الخلايا تقديم (APCs) أمر ضروري لتطوير GVHD. من بين APCs، الخلايا التشجرات (DCs) هي الأقوى. فهي قادرة على إحداث GVHD بشكل موروث بسبب الإنتضاد الأعلى، والتعبير عن جزيئات T-cell المشتركة المحفزة، وإنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات التي تستقطب الخلايا التائية إلى مجموعات فرعية مسببة للأمراض. البلدان النامية المتلقية حاسمة لتسهيل فتيلة الخلايا T والتعريفي GVHD بعد زرع11،12. وبناء على ذلك، أصبحت البلدان النامية أهدافا مثيرة للاهتمام في علاج GVHD12.
مطلوب TBI لتعزيز الترقيع الخلية المانحة. بسبب تأثير TBI ، يتم تنشيط البلدان النامية المتلقية والبقاء على قيد الحياة لفترة قصيرة بعد زرع12. وعلى الرغم من التقدم الكبير في استخدام الإضاءة الحيوية أو الفلور، فإن إنشاء نموذج فعال لدراسة دور البلدان النامية المتلقية في الـ GVHD لا يزال يشكل تحدياً.
لأن الخلايا التائية المانحة هي القوة الدافعة لنشاط GVL ، فإن استراتيجيات العلاج باستخدام الأدوية المثبطة للمناعة مثل المنشطات لقمع الخلايا التائية غالبًا ما تسبب انتكاسة الورم أو العدوى13. ولذلك، فإن استهداف البلدان النامية المتلقية قد يوفر نهجاً بديلاً لعلاج الـ GVHD مع الحفاظ على تأثير GVL وتجنب العدوى.
باختصار، توفر الدراسة الحالية منصة لفهم كيفية تنظيم أنواع مختلفة من الإشارات في البلدان النامية المتلقية لتطوير GVHD وتأثير GVL بعد BMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام الخلايا الجذعية لتناسب فرد معين هو نهج فعال لعلاج السرطانات المتقدمة والمقاومة18. المستحضرات الصيدلانية جزيء صغير، ومع ذلك، ظلت لفترة طويلة التركيز الرئيسي لعلاج السرطان شخصية. من ناحية أخرى ، في العلاج الخلوي يمكن أن تؤثر العديد من التفاعلات بين المانح والمضيف بشكل …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذه الدراسة من جامعة وسط فلوريدا كلية الطب بدء المنحة (لHN), جامعة بيتسبرغ المركز الطبي هيلمان مركز السرطان بدء منحة (إلى HL), الولايات المتحدة المعاهد القومية للصحة منحة #1P20CA210300-01 ووزارة الصحة الفيتنامية منحة #4694/ QD-BYT (إلى PTH). نشكر الدكتور شيوي تشونغ يو في جامعة كارولينا الجنوبية الطبية لتوفير المواد اللازمة للدراسة.
Materials
| 0.5 M EDTA pH 8.0 100ML | Fisher Scientific | BP2482100 | MACS buffer |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP3994 | MACS buffer |
| A20 B-cell lymphoma | University of Central Florida | In house | GVL experiment |
| ACC1 fl/fl | Jackson Lab | 30954 | GVL experiment |
| ACC1 fl/fl CD4cre | University of Central Florida | GVL experiment | |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | T-cell enrichment |
| Anti-Human/Mouse CD45R (B220) | Thermo Fisher Scientific | 13-0452-85 | T-cell enrichment |
| Anti-mouse B220 FITC | Thermo Fisher Scientific | 10452-85 | Flow cytometry analysis |
| Anti-mouse CD11c- AF700 | Thermo Fisher Scientific | 117319 | Flow cytometry analysis |
| Anti-Mouse CD25 PE | Thermo Fisher Scientific | 12-0251-82 | Flow staining |
| Anti-Mouse CD4 Biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-0041-86 | T-cell enrichment |
| Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) | Thermo Fisher Scientific | 48-0042-82 | Flow staining |
| Anti-mouse CD45.1 PE | Thermo Fisher Scientific | 12-0900-83 | Flow cytometry analysis |
| Anti-Mouse CD8a APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0081-83 | Flow cytometry analysis |
| Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-5958-82 | Flow cytometry analysis |
| Anti-mouse MHC Class II-antibody APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5320-82 | Flow cytometry analysis |
| Anti-Mouse TER-119 Biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-5921-85 | T-cell enrichment |
| Anti-Thy1.2 | Bio Excel | BE0066 | BM generation |
| B6 fB-/- mice | University of Central Florida | In house | Recipients |
| B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice | Charles River | 564 | Donors |
| BALB/c mice | Charles River | 028 | Transplant recipients |
| C57BL/6 mice | Charles River | 027 | Donors/Recipients |
| CD11b | Thermo Fisher Scientific | 13-0112-85 | T-cell enrichment |
| CD25-biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-0251-82 | T-cell enrichment |
| CD45R | Thermo Fisher Scientific | 13-0452-82 | T-cell enrichment |
| CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-5971-82 | T-cell enrichment |
| Cell strainer 40 uM | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | Cell preparation |
| Cell strainer 70 uM | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | Cell preparation |
| D-Luciferin | Goldbio | LUCK-1G | Live animal imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Bilogicals R&D system | D17051 | Cell Culture |
| Flow cytometry tubes | Fisher Scientific | 352008 | Flow cytometry analysis |
| FVB/NCrl | Charles River | 207 | Donors |
| Lipopolysacharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391-1MG | DC mature |
| LS column | Mitenyi Biotec | 130-042-401 | Cell preparation |
| MidiMACS | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | T-cell enrichment |
| New Brunswick Galaxy 170R incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | Cell Culture |
| Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | Media |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scienctific | 11875-093 | Media |
| TER119 | Thermo Fisher Scientific | 13-5921-82 | T-cell enrichment |
| Xenogen IVIS-200 | Perkin Elmer | Xenogen IVIS-200 | Live animal imaging |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-RAY | X-RAD 320 | Total Body Irradiation |
Referências
- Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
- Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
- Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).
- Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. 2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).
- Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).
- Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation. ILAR Journal. , ily006 (2018).
- Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD. Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).
- Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease. The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).
- Lu, Y., Waller, E. K. Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).
- Abdollahi, A., et al. Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia. Blood. 119, 5088-5103 (2012).
- Ullmann, A. J., et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease. New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).
- Dittel, B. N. Depletion of specific cell populations by complement depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Nguyen, H. D., et al. Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation. Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).
- Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
- Nguyen, H., et al. Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells. Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).
- McNutt, M. Cancer immunotherapy. Science. 342, 1417 (2013).
- Negrin, R. S., Contag, C. H. In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease. Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).
- Roy, D. C., Perreault, C. Major vs minor histocompatibility antigens. Blood. 129, 664-666 (2017).
- Gendelman, M., et al. Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).
- Li, J., et al. HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease. Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).
- Zeiser, R., et al. Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease. Blood. 109, 2225-2233 (2007).
- Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).
