Knochenmarktransplantationsplattform zur Untersuchung der Rolle dendritischer Zellen bei Graft-versus-Host-Krankheit
Summary
Graft-versus-Host-Krankheit ist eine große Komplikation nach allogenen Knochenmarktransplantation. Dendritische Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Transplantat-versus-Host-Krankheit. Der aktuelle Artikel beschreibt eine neuartige Knochenmarktransplantationsplattform, um die Rolle dendritischer Zellen bei der Entwicklung von Transplantat-versus-Host-Krankheit und dem Transplantat-versus-Leukämie-Effekt zu untersuchen.
Abstract
Allogene Knochenmarktransplantation (BMT) ist eine wirksame Therapie bei hämatologischen Malignitäten aufgrund des Transplantat-versus-Leukämie-Effekts (GVL), um Tumore auszurotten. Jedoch, seine Anwendung ist durch die Entwicklung der Transplantat-versus-Host-Krankheit (GVHD), eine große Komplikation von BMT begrenzt. GVHD wird evoziert, wenn T-Zellen in den Spendertransplantaten alloantigen erkennen, das von Empfängerzellen exprimiert wird, und unerwünschte immunologische Angriffe auf gesunde Gewebe des Empfängers durchführen. So sind traditionelle Therapien entwickelt, um Spender T-Zell Alloreaktivität zu unterdrücken. Diese Ansätze beeinträchtigen jedoch den GVL-Effekt erheblich, so dass das Überleben des Empfängers nicht verbessert wird. Das Verständnis der Auswirkungen therapeutischer Ansätze auf BMT, GVL und GVHD ist daher von wesentlicher Bedeutung. Aufgrund der Antigen-präsentations- und Zytokin-Sekretionskapazitäten zur Stimulierung von Spender-T-Zellen spielen empfänger dendritische Zellen (DCs) eine wichtige Rolle bei der Induktion von GVHD. Daher wird die Ausrichtung von Empfänger-DCs zu einem potenziellen Ansatz für die Steuerung von GVHD. Diese Arbeit bietet eine Beschreibung einer neuartigen BMT-Plattform, um zu untersuchen, wie Host DCs GVH- und GVL-Antworten nach der Transplantation regulieren. Ebenfalls vorgestellt wird ein effektives BMT-Modell zur Untersuchung der Biologie von GVHD und GVL nach der Transplantation.
Introduction
Allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (BMT) ist eine wirksame Therapie zur Behandlung hämatologischer Malignome1,2 durch den Transplantat-versus-Leukämie-Effekt (GVL)3. Spenderlymphozyten führen jedoch immer unerwünschte immunologische Angriffe auf Empfängergewebe ein, ein Prozess, der als Transplantat-versus-Host-Krankheit (GVHD)4bezeichnet wird.
Murine Modelle von GVHD sind ein wirksames Werkzeug, um die Biologie der GVHD und die GVL-Antwort5zu studieren. Mäuse sind ein kostengünstiges Forschungstiermodell. Sie sind klein und effizient mit Molekülen und Biologika in frühen Phasen der Entwicklung6dosiert. Mäuse sind ideale Forschungstiere für genetische Manipulationsstudien, weil sie genetisch gut definiert sind, was ideal für die Untersuchung biologischer Pfade und Mechanismen ist6. Mehrere Maus-Haupt-Histokompatibilitätskomplex (MHC) MHC-unübereinstimmende Modelle von GVHD haben sich gut etabliert, wie C57BL/6 (H2b) zu BALB/c (H2d) und FVB (H2q)’C57BL/6 (H2b)5,7. Dies sind besonders wertvolle Modelle, um die Rolle einzelner Zelltypen, Gene und Faktoren zu bestimmen, die GVHD beeinflussen. Die Transplantation von C57/BL/6 (H2b) Elternspendern an Empfänger mit Mutationen in MHC I (B6.C-H2bm1) und/oder MHC II (B6.C-H2bm12) ergab, dass eine Diskrepanz sowohl in der MHC-Klasse I als auch in der Klasse II eine wichtige Voraussetzung für die Entwicklung von akutem GVHD ist. Dies deutet darauf hin, dass sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zellen für die Krankheitsentwicklung7,8benötigt werden. GVHD ist auch an einer entzündlichen Kaskade beteiligt, die als “pro-inflammatorischezytokine Sturm”9bekannt ist. Die häufigste Konditionierungsmethode in murinen Modellen ist die Ganzkörperbestrahlung (TBI) durch Röntgen oder 137Cs. Dies führt zur Knochenmarkablation des Empfängers, wodurch eine Spenderstammzelltransplantation ermöglicht und eine Abstoßung des Transplantats verhindert wird. Dies geschieht durch die Begrenzung der Proliferation von Empfänger-T-Zellen als Reaktion auf Spenderzellen. Darüber hinaus spielen genetische Disparitäten eine wichtige Rolle bei der Krankheitsinduktion, die auch von geringfügigen MHC-Mismatch10abhängt. Daher variiert die myeloablative Bestrahlungsdosis in verschiedenen Mausstämmen (z. B. BALB/c-C57BL/6).
Die Aktivierung von Spender-T-Zellen durch Wirtsantigen-präsentierende Zellen (APCs) ist für die GVHD-Entwicklung unerlässlich. Unter den APCs sind dendritische Zellen (DCs) die stärksten. Sie sind vererbbar in der Lage, GVHD aufgrund ihrer überlegenen Antigenaufnahme, expression ierung von T-Zell-Kostimulierenden Molekülen und der Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen, die T-Zellen zu pathogenen Teilmengen polarisieren, zu induzieren. Empfänger-DCs sind entscheidend für die Erleichterung der T-Zell-Grundierung und GVHD-Induktion nach der Transplantation11,12. Dementsprechend sind DCs zu interessanten Zielen bei der Behandlung von GVHD12geworden.
TBI ist erforderlich, um die Spenderzelltransplantation zu verbessern. Durch den TBI-Effekt werden Empfänger-DCs aktiviert und überleben nach der Transplantationkurzzeitig 12. Trotz erheblicher Fortschritte bei der Verwendung von Biolumineszenz oder Fluoreszenz ist die Etablierung eines effektiven Modells zur Untersuchung der Rolle von Empfänger-DCs bei der GVHD nach wie vor eine Herausforderung.
Da Spender-T-Zellen die treibende Kraft für GVL-Aktivität sind, Behandlungsstrategien mit immunsuppressiven Medikamenten wie Steroiden zur Unterdrückung der T-Zell-Alloreaktivität verursachen oft Tumorrückfall oder Infektion13. Daher kann die Ausrichtung auf Empfänger-DCs einen alternativen Ansatz zur Behandlung von GVHD bieten, während der GVL-Effekt erhalten und Infektionen vermieden werden.
Kurz gesagt, die aktuelle Studie bietet eine Plattform, um zu verstehen, wie verschiedene Arten der Signalisierung in Empfänger-DCs die GVHD-Entwicklung und den GVL-Effekt nach BMT regulieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Verwendung von Stammzellen für eine bestimmte Person ist ein effektiver Ansatz zur Behandlung von fortgeschrittenen und resistenten Krebsarten18. Kleine Molekülpharmazeutika sind jedoch seit langem ein Hauptfokus der personalisierten Krebstherapie. Andererseits kann in der Zelltherapie eine Vielzahl von Wechselwirkungen zwischen Spender und Wirt die Behandlungsergebnisse entscheidend beeinflussen, wie z.B. die Entwicklung von GVHD nach BMT1.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wird unterstützt durch das Start-up-Stipendium des University of Central Florida College of Medicine (an HN), das Start-up-Stipendium des University of Pittsburgh Medical Center Hillman Cancer Center (an HL), das United States NIH Grant #1P20CA210300-01 und das vietnamesische Gesundheitsministerium Grant #4694/QD-BYT (zu PTH). Wir danken Dr. Xue-zhong Yu von der Medical University of South Carolina für die Bereitstellung von Materialien für die Studie.
Materials
| 0.5 M EDTA pH 8.0 100ML | Fisher Scientific | BP2482100 | MACS buffer |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP3994 | MACS buffer |
| A20 B-cell lymphoma | University of Central Florida | In house | GVL experiment |
| ACC1 fl/fl | Jackson Lab | 30954 | GVL experiment |
| ACC1 fl/fl CD4cre | University of Central Florida | GVL experiment | |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | T-cell enrichment |
| Anti-Human/Mouse CD45R (B220) | Thermo Fisher Scientific | 13-0452-85 | T-cell enrichment |
| Anti-mouse B220 FITC | Thermo Fisher Scientific | 10452-85 | Flow cytometry analysis |
| Anti-mouse CD11c- AF700 | Thermo Fisher Scientific | 117319 | Flow cytometry analysis |
| Anti-Mouse CD25 PE | Thermo Fisher Scientific | 12-0251-82 | Flow staining |
| Anti-Mouse CD4 Biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-0041-86 | T-cell enrichment |
| Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) | Thermo Fisher Scientific | 48-0042-82 | Flow staining |
| Anti-mouse CD45.1 PE | Thermo Fisher Scientific | 12-0900-83 | Flow cytometry analysis |
| Anti-Mouse CD8a APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0081-83 | Flow cytometry analysis |
| Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-5958-82 | Flow cytometry analysis |
| Anti-mouse MHC Class II-antibody APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5320-82 | Flow cytometry analysis |
| Anti-Mouse TER-119 Biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-5921-85 | T-cell enrichment |
| Anti-Thy1.2 | Bio Excel | BE0066 | BM generation |
| B6 fB-/- mice | University of Central Florida | In house | Recipients |
| B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice | Charles River | 564 | Donors |
| BALB/c mice | Charles River | 028 | Transplant recipients |
| C57BL/6 mice | Charles River | 027 | Donors/Recipients |
| CD11b | Thermo Fisher Scientific | 13-0112-85 | T-cell enrichment |
| CD25-biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-0251-82 | T-cell enrichment |
| CD45R | Thermo Fisher Scientific | 13-0452-82 | T-cell enrichment |
| CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-5971-82 | T-cell enrichment |
| Cell strainer 40 uM | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | Cell preparation |
| Cell strainer 70 uM | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | Cell preparation |
| D-Luciferin | Goldbio | LUCK-1G | Live animal imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Bilogicals R&D system | D17051 | Cell Culture |
| Flow cytometry tubes | Fisher Scientific | 352008 | Flow cytometry analysis |
| FVB/NCrl | Charles River | 207 | Donors |
| Lipopolysacharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391-1MG | DC mature |
| LS column | Mitenyi Biotec | 130-042-401 | Cell preparation |
| MidiMACS | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | T-cell enrichment |
| New Brunswick Galaxy 170R incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | Cell Culture |
| Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | Media |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scienctific | 11875-093 | Media |
| TER119 | Thermo Fisher Scientific | 13-5921-82 | T-cell enrichment |
| Xenogen IVIS-200 | Perkin Elmer | Xenogen IVIS-200 | Live animal imaging |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-RAY | X-RAD 320 | Total Body Irradiation |
Referências
- Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
- Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
- Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).
- Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. 2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).
- Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).
- Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation. ILAR Journal. , ily006 (2018).
- Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD. Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).
- Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease. The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).
- Lu, Y., Waller, E. K. Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).
- Abdollahi, A., et al. Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia. Blood. 119, 5088-5103 (2012).
- Ullmann, A. J., et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease. New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).
- Dittel, B. N. Depletion of specific cell populations by complement depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Nguyen, H. D., et al. Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation. Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).
- Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
- Nguyen, H., et al. Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells. Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).
- McNutt, M. Cancer immunotherapy. Science. 342, 1417 (2013).
- Negrin, R. S., Contag, C. H. In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease. Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).
- Roy, D. C., Perreault, C. Major vs minor histocompatibility antigens. Blood. 129, 664-666 (2017).
- Gendelman, M., et al. Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).
- Li, J., et al. HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease. Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).
- Zeiser, R., et al. Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease. Blood. 109, 2225-2233 (2007).
- Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).
