JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

이식대 숙주 질환에서 수지상 세포의 역할을 조사하는 골수 이식 플랫폼

Published: March 17, 2020
doi:
10.3791/60083
, , , , , , , ,
1Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences,University of Central Florida, 2Department of Biochemistry,Hanoi University of Pharmacy, 3Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences,Houston Methodist Research Institute, 4Department of Epidemiology,University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, 5Division of Cancer Control and Population Sciences,University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center

Summary

이식편 대 숙주 질병은 동종 골수 이식 후에 중요한 합병증입니다. 수지상 세포는 이식편 대 숙주 질환의 발병기전에 중요한 역할을 합니다. 현재 논문은 이식편 대 숙주 질환및 이식편 대 백혈병 효과의 발달에 있는 수지상 세포의 역할을 조사하기 위하여 새로운 골수 이식 플랫폼을 기술합니다.

Abstract

동종 골수 이식 (BMT)은 종양을 근절하기 위한 이식편 대 백혈병 (GVL) 효과로 인한 혈액학적 악성 종양에 대한 효과적인 치료법입니다. 그러나, 그것의 응용은 BMT의 중요한 합병증인 이식편 대 호스트 질병 (GVHD)의 발달에 의해 제한됩니다. GVHD는 기증자 이식편에서 T 세포가 수용자 세포에 의해 발현된 alloantigen을 인식하고 수령인 건강한 조직에 대하여 원치 않는 면역학적 공격을 탑재할 때 불러오릅니다. 따라서, 전통적인 치료는 기증자 T 세포 동호성을 억제하도록 설계되었습니다. 그러나, 이러한 접근법은 수신자의 생존이 개선되지 않도록 GVL 효과를 실질적으로 손상시다. 따라서 BMT, GVL 및 GVHD에 대한 치료 접근법의 효과를 이해하는 것이 필수적입니다. 공여자 T 세포를 자극하는 항원 제시 및 사이토카인 분비 용량으로 인해, 수용자 수지상 세포(DC)는 GVHD의 유도에 중요한 역할을 한다. 따라서 받는 DC를 대상으로 하는 것은 GVHD를 제어하기 위한 잠재적인 접근 방식이 됩니다. 이 작품은 호스트 DC가 이식 후 GVH 및 GVL 응답을 조절하는 방법을 조사하는 새로운 BMT 플랫폼에 대한 설명을 제공합니다. 또한 이식 후 GVHD 및 GVL의 생물학을 연구하는 효과적인 BMT 모델이다.

Introduction

동종 조혈 줄기 세포 이식(BMT)은 이식편 대 백혈병(GVL)효과를,통해 혈액학적 악성종양을치료하는 효과적인 치료법3. 그러나, 기증자 림프톨은 항상 수용자 조직에 대하여 원치 않는 면역학 공격을 거치고, 이식편 대 호스트 질병에게 불린 프로세스 (GVHD)4.

GVHD의 뮤린 모델은 GVHD와 GVL응답5의생물학을 연구하는 효과적인 도구입니다. 마우스는 비용 효율적인 연구 동물 모델입니다. 그들은 작고 효율적으로 개발6의초기 단계에서 분자와 생물학적 제제로 dosed. 마우스는 생물학적 경로 및 메커니즘을 연구하는 데 이상적인 유전적 조작 연구를 위한 이상적인 연구 동물이며, 이는 생물학적 경로 및 메커니즘을 연구하는 데 이상적입니다6. 여러 마우스 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) GVHD의 MHC 불일치 모델은 잘 설립되었습니다, 이러한 BALB / c에 (H2b)및 FVB (H2 q)와 FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)b5,,7. 이들은 GVHD에 영향을 미치는 개별적인 세포 모형, 유전자 및 요인의 역할을 결정하기 위하여 특히 귀중한 모형입니다. C57/BL/6 (H2b)MHC I (B6.C-H2bm1)및/또는 MHC II (B6.C-H2bm12)에서돌연변이를 가진 수령인에게 부모 기증자로부터의 이식은 MHC 클래스 I 및 클래스 II 모두에서 불일치가 급성 GVHD의 발달을 위한 중요한 요구 사항임을 밝혔다. 이는CD4+ 및 CD8+ T 세포가 질병발달7,,8에모두 필요하다는 것을 시사한다. GVHD는 또한 ‘프로 염증성 사이토카인 폭풍’으로 알려진 염증성 캐스케이드에관여9. 뮤린 모델에서 가장 일반적인 컨디셔닝 방법은 X 선 또는 137Cs에 의한 총 체조사(TBI)입니다. 이것은 수령인의 골수 절제로 이끌어 내고, 기증자 줄기 세포 생착을 허용하고 이식의 거부를 방지합니다. 이것은 공여자 세포에 응하여 수용자 T 세포의 증식을 제한해서 행해진다. 추가적으로, 유전 불균형은 또한 경미한 MHC 불일치10에달려 있는 질병 유도에 있는 중요한 역할을 합니다. 따라서, 골수성 조사 량은 상이한 마우스 균주(예를 들어, BALB/c→C57BL/6)에서 다양하다.

숙주 항원 제시 세포(APC)에 의한 공여자 T 세포의 활성화는 GVHD 발달에 필수적이다. APC 중 수지상 세포 (DC)가 가장 강력합니다. 그(것)들은 그들의 우수한 항원 장악, T 세포 공동 자극 분자의 표현 및 병원성 부세트로 T 세포를 편광하는 pro-염증성 사이토카인의 생산 때문에 GVHD를 유도할 수 승계할 수 있습니다. 수용자 DC는 이식 후 T 세포 프라이밍 및 GVHD 유도를 촉진하는 데 매우 중요합니다11,,12. 따라서, DC는 GVHD12의치료에 흥미로운 표적이되고있다.

TBI는 공여자 세포 생착을 향상시키기 위해 요구된다. TBI 효과로 인해, 수용자 DC는 이식 후 짧은 시간 동안 활성화되고생존(12). 생물 발광 또는 형광의 사용이 크게 발전했음에도 불구하고 GVHD에서 받는 DC의 역할을 연구하는 효과적인 모델을 수립하는 것은 여전히 어려운 일입니다.

공여자 T세포는 GVL 활성의 원동력이기 때문에, 스테로이드와 같은 면역억제제를 이용한 치료 전략은 종종 종양 재발 또는 감염을 유발한다13. 따라서, 대상자 DC를 타겟팅하는 것은 GVL 효과를 보존하고 감염을 피하면서 GVHD를 치료하는 다른 접근법을 제공할 수 있다.

간단히 말해서, 현재 연구는 수신자 DC에서 신호의 다른 유형이 BMT 후 GVHD 개발 및 GVL 효과를 조절하는 방법을 이해하는 플랫폼을 제공합니다.

Protocol

실험 절차는 중앙 플로리다 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 1. GVHD 유도 참고: 동종 골수 (BM) 세포 이식 (단계 1.2) 조사 후 24 시간 이내에 수행된다. 아래에 설명된 모든 절차는 멸균 환경에서 수행됩니다. 조직 배양 후드에서 절차를 수행하고 여과 된 시약을 사용하십시오. 일 0: 받는 마우스를 준비합니다. BALB/c 배경(…

Representative Results

주요 MHC-불일치 B6 (H2kbb)-BALB/C (H2kd)모델은 이식 후 GVHD 개발에 밀접하게 대응하였다(그림2). Cooke et al.16에 의해 이전에 확립된 모든 6개의 GVHD 임상 징후는 WT-B6 T 세포로 이식된 수용자에서 발생하지만, GVHD 음성 군을 나타내는 BM 단독으로 이식된 수용자(단계 1.5)에서는 발생하지 않았다. 이 모델에는 GVHD 개발에 두 단?…

Discussion

특정 개인에 맞게 줄기 세포의 사용은 고급 및 내성 암을 치료하는 효과적인 접근 이다18. 작은 분자 약제는, 그러나, 개인화한 암 치료의 1 차적인 초점으로 오래 남아 있습니다. 한편, 세포 치료에서 기증자와 숙주 간의 다수 상호작용은 BMT1후 GVHD의 발달과 같은 치료 결과에 결정적으로 영향을 미칠 수 있다.

BMT의 주요 MHC 불일치 마우스 모?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 의학의 중앙 플로리다 대학 의과 대학 창업 보조금의 대학에 의해 지원된다 (HN에), 피츠버그 의료 센터 힐만 암 센터 스타트 업 보조금의 대학 (HL에), 미국 NIH 그랜트 #1P20CA210300-01 및 건강 보조금 #4694 / QD-BYT의 베트남 정부 (PTH에). 우리는 연구를 위한 자료를 제공한 사우스 캐롤라이나 의과 대학에 박사 Xue-zhong Yu 에게 감사합니다.

Materials

0.5 M EDTA pH 8.0 100ML Fisher Scientific BP2482100 MACS buffer
10X PBS Fisher Scientific BP3994 MACS buffer
A20 B-cell lymphoma University of Central Florida In house GVL experiment
ACC1 fl/fl Jackson Lab 30954 GVL experiment
ACC1 fl/fl CD4cre University of Central Florida GVL experiment
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485 T-cell enrichment
Anti-Human/Mouse CD45R (B220) Thermo Fisher Scientific 13-0452-85 T-cell enrichment
Anti-mouse B220 FITC Thermo Fisher Scientific 10452-85 Flow cytometry analysis
Anti-mouse CD11c- AF700 Thermo Fisher Scientific 117319 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD25 PE Thermo Fisher Scientific 12-0251-82 Flow staining
Anti-Mouse CD4 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-0041-86 T-cell enrichment
Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) Thermo Fisher Scientific 48-0042-82 Flow staining
Anti-mouse CD45.1 PE Thermo Fisher Scientific 12-0900-83 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD8a APC Thermo Fisher Scientific 17-0081-83 Flow cytometry analysis
Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 Thermo Fisher Scientific 46-5958-82 Flow cytometry analysis
Anti-mouse MHC Class II-antibody APC Thermo Fisher Scientific 17-5320-82 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse TER-119 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-5921-85 T-cell enrichment
Anti-Thy1.2 Bio Excel BE0066 BM generation
B6 fB-/- mice University of Central Florida In house Recipients
B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice Charles River 564 Donors
BALB/c mice Charles River 028 Transplant recipients
C57BL/6 mice Charles River 027 Donors/Recipients
CD11b Thermo Fisher Scientific 13-0112-85 T-cell enrichment
CD25-biotin Thermo Fisher Scientific 13-0251-82 T-cell enrichment
CD45R Thermo Fisher Scientific 13-0452-82 T-cell enrichment
CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin Thermo Fisher Scientific 13-5971-82 T-cell enrichment
Cell strainer 40 uM Thermo Fisher Scientific 22363547 Cell preparation
Cell strainer 70 uM Thermo Fisher Scientific 22363548 Cell preparation
D-Luciferin Goldbio LUCK-1G Live animal imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Bilogicals R&D system D17051 Cell Culture
Flow cytometry tubes Fisher Scientific 352008 Flow cytometry analysis
FVB/NCrl Charles River 207 Donors
Lipopolysacharide (LPS) Millipore Sigma L4391-1MG DC mature
LS column Mitenyi Biotec 130-042-401 Cell preparation
MidiMACS Miltenyi Biotec 130-042-302 T-cell enrichment
New Brunswick Galaxy 170R incubator Eppendorf Galaxy 170 R Cell Culture
Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140 Media
RPMI 1640 Thermo Fisher Scienctific 11875-093 Media
TER119 Thermo Fisher Scientific 13-5921-82 T-cell enrichment
Xenogen IVIS-200 Perkin Elmer Xenogen IVIS-200 Live animal imaging
X-RAD 320 Biological Irradiator Precision X-RAY X-RAD 320 Total Body Irradiation
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
  2. Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
  3. Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).
  4. Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. 2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).
  5. Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).
  6. Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation. ILAR Journal. , ily006 (2018).
  7. Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD. Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).
  8. Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease. The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).
  9. Lu, Y., Waller, E. K. Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).
  10. Abdollahi, A., et al. Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).
  11. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  12. Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia. Blood. 119, 5088-5103 (2012).
  13. Ullmann, A. J., et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease. New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).
  14. Dittel, B. N. Depletion of specific cell populations by complement depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  15. Nguyen, H. D., et al. Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation. Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).
  16. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
  17. Nguyen, H., et al. Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells. Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).
  18. McNutt, M. Cancer immunotherapy. Science. 342, 1417 (2013).
  19. Negrin, R. S., Contag, C. H. In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease. Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).
  20. Roy, D. C., Perreault, C. Major vs minor histocompatibility antigens. Blood. 129, 664-666 (2017).
  21. Gendelman, M., et al. Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).
  22. Li, J., et al. HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease. Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).
  23. Zeiser, R., et al. Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease. Blood. 109, 2225-2233 (2007).
  24. Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).

Tags

Keywords: Bone Marrow TransplantationDendritic CellsGraft-versus-host DiseaseT-cell DepletionCell IsolationCell CultureImmune Cell PopulationsMacrophagesNeutrophilsCell RegenerationBone Marrow PreparationCell HarvestingCell StrainingCell WashingCell ResuspensionCell IncubationCell CountingCell Pooling
check_url/pt/60083?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Nguyen, H. D., Huong, P. T., Hossack, K., Gurshaney, S., Ezhakunnel, K., Huynh, T., Alvarez, A. M., Le, N., Luu, H. N. Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease. J. Vis. Exp. (157), e60083, doi:10.3791/60083 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image