Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

אפיון של תא החיסון-מסחטות נגזרות ושלפוחיות ולימוד השפעה פונקציונלית על סביבת התא

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/60118
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

Summary

הדו ח הנוכחי מדגיש את הדרישות כרונולוגי לחילוץ שלפוחית לפוחית (EV) בידוד מ מיקרוגלייה או דם מקרופאגים. Microglia-EVs נגזר הוערכו כרגולטורים של neurite מוצלח בעוד דם מקרופאג-נגזר EVs נחקרו בשליטה של הפלישה C6 glioma תא ב מבחנה. המטרה היא להבין טוב יותר אלה פונקציות EV כמו מגשרים החיסונית במיקרו סביבות מסוימות.

Abstract

מצב הנוירודלקתי של מערכת העצבים המרכזית (CN) ממלא תפקיד מרכזי בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. Microglia, התאים החיסוניים תושב במוח, ולפעמים את מח עצם החדירה מקרופאגים (BMDMs), לווסת את הפרופיל הדלקתי של המיקרוסביבה שלהם ב-CN. עכשיו זה מקובל כי החילוץ שלפוחית הזרע (EV) אוכלוסיות מתאי החיסון לפעול כמגשרים החיסונית. לפיכך, האיסוף והבידוד שלהם חשובים לזיהוי תוכנם, אך גם להערכת ההשפעות הביולוגיות שלהם על תאי הנמען. הנתונים הנוכחיים להדגיש דרישות כרונולוגי עבור EV בידוד מתאי מיקרוגלייה או דם מקרופאגים כולל ביטול הקוד הכולל ואת גודל ההדרה כרומטוגרפיה (SEC) צעדים. ניתוח פרוטמית לא ממוקד התיר את האימות של חתימות חלבון כמו סמנים EV והתאפיין את תוכן EV פעיל ביולוגית. Microglia-EVs נגזר היו גם בשימוש פונקציונלי על התרבות העיקרית של נוירונים כדי להעריך את החשיבות שלהם כמגשרים החיסונית neurite outgrowth. התוצאות הראו כי מיקרוגליה נגזר EVs לתרום כדי להקל על neurite מוצלח בתוך מבחנה. במקביל, דם מקרופאג נגזר EVs היו בשימוש פונקציונלי כמגשרים החיסונית בתרבויות ספרואיד של התאים C6 glioma, התוצאות מראה כי אלה EVs שלוט הפלישה התאים glioma בתוך מבחנה. דו ח זה מדגיש את האפשרות להעריך את הפונקציות של תא החיסון EV-בתיווך, אך גם להבין את הבסיסים המולקולריים של תקשורת כזו. פענוח זה יכול לקדם את השימוש בשלפוחיות טבעיות ו/או בהכנת הפריה חוץ גופית של שלפוחיות טיפוליות כדי לחקות את התכונות החסינות של המיקרו-סביבה של הפתווגיות של ה-CN.

Introduction

נוירופתוגיות רבות קשורות למצב הנוירו-דלקתי שהוא מנגנון מורכב שנחשב יותר ויותר, אך עדיין מובן בצורה גרועה משום שהתהליכים החיסוניים מגוונים ותלויים בסביבת התא. אכן, הפרעות ה-CN לא מערבת בשיטתיות את אותם אותות הפעלה ואוכלוסיות תאים החיסונית ולכן התגובות pro-או אנטי דלקתיות קשה להעריך כסיבות או השלכות של הפתווגיות. מקרופאגים תושב המוח בשם "microglia" נראה להיות בממשק בין מערכת העצבים והחיסונית1. Microglia יש מוצא מיאלואידית ונגזר שק החלמון במהלך המטפיאה פרימיטיבי ליישב את המוח, ואילו מקרופאגים היקפיים נגזרות הכבד עובר במהלך המטפיאה הסופית להפוך מקרופאגים היקפיים2. התאים מיקרוגלייה לתקשר עם נוירונים ותאי העצב-הנגזרים הנגזרות גליה כגון אסטרוציטים ו oligodendrocytes הפוך3. מספר מחקרים שנעשו לאחרונה הוכיחו כי מיקרוגלייה מעורבים בפלסטיות העצבית במהלך פיתוח המוח והומאוסטזיס רקמות למבוגרים, וגם במצב דלקתי הקשורים עם מחלות ניווניות4,5. אחרת, את היושרה של מכשול המוח בדם ניתן להתפשר על הפתווגיות אחרות. התגובות החיסונית, במיוחד בסרטן gliנובלסטומה מרובה, אינם נתמכים רק על ידי תאים מיקרוגלייה כמו מכשול המוח בדם הוא מאורגן מראש דרך תהליכים אנגיוגנטית ונוכחות של כלי הלימפה6,7. לכן, מח עצם גדול הנגזר מקרופאגים (BMDMs) הסתננות מתרחשת בגידול במוח ברחבי הגידול תלויי מנגנוני אנגיוגנזה8. התאים הסרטניים להפעיל השפעה משמעותית על מסכת BMDMs המובילה לתכונות מדכאים חיסוני וצמיחה גידול9. לפיכך, התקשורת בין התאים החיסוניים לבין מיקרואקולוגיה המוחית קשה להבנה כאשר מקור התאים ואותות ההפעלה מגוונים ב-10,11. ולכן מעניין לעצור את התפקודים של חתימות מולקולריות הקשורות לתאי החיסון בתנאים פיסיולוגיים. בהקשר זה, התקשורת תא התא בין תאים חיסוניים לבין מיקרוסביבה התא ניתן ללמוד באמצעות שחרור של שלפוחיות ושלפוחית (EVs).

הEVs מתוחקר יותר ויותר בוויסות התפקודים החיסוניים בריאים ובתנאים פתולוגיים12,13. ניתן לקחת בחשבון שתי אוכלוסיות, אקזומים ומיקרוטיבים. הם מציגים טווחי ביוגנזה וגדלים שונים. האקסוזומים הם שלפוחיות של ~ 30 – 150 בקוטר nm והם מופקים ממערכת אנדוזוממית מופרש במהלך המיזוג של גופים multivesicular (MVBs) עם קרום פלזמה. המיקרושלפוחיות הם כ-100 – 1000 ננומטר בקוטר והם מופקים על ידי החוצה מתוך ממברנה פלזמה תא14. מכיוון שהאקסוחלק לעומת האפליה המיקרובעית עדיין קשה להבין לפי הגודל והדפוסים המולקולריים, נשתמש רק במונח EVs בדו ח הנוכחי. התקשורת המשויכת EV המייצגת את מנגנון האבות הקדמון מאז המחקרים הראו את מעורבותם במינים חסרי חוליות, כולל נמטודס, חרקים או annelids15,16. יתר על כן, התוצאות מראות כי EVs יכול לתקשר עם תאים ממינים שונים להפגין מנגנון זה להיות מערכת נעילת מפתח, מבוסס על הראשון על פני השטח מולקולה זיהוי בין שלפוחיות ותאי הנמען ולאחר מכן מאפשר את ספיגת המגשרים16,17. אכן, EVs מכילים מולקולות רבות כמו חלבונים (למשל, אנזימים, התמרה אותות, ביוגנזה פקטור), שומנים (g., ceramide, כולסטרול) או חומצות גרעין (g., DNA, mRNA או miRNAs) מתנהג כמו הרגולטורים ישיר או עקיף של פעילויות תא הנמען14. זו הסיבה מחקרים מתודולוגיים נערכו גם על תאים חיסוניים כדי לבודד EVs ולאפיין במלואו את חתימות החלבון שלהם18,19.

המחקרים המוקדמים ביותר הפגינו שחרורו של אקסוזומים מיקרוגליה הראשי של חולדה תרבותית כמנגנון inducible בעקבות הפעלה התלויה Wnt3a או סרוטונין20,21. מבחינה פונקציונלית בתוך המוח, microglia-נגזר EVs להסדיר את השחרור שלפוחית סינפטית על ידי מסופים טרום סינפטיות בנוירונים תורמים לשליטה של היכולת העצבית הנוירולית22,23. Microglia-נגזר EVs יכול גם להפיץ את התגובה הדלקתית ציטוקינים בתיווך באזורים גדולים במוח24,25. חשוב מכך, ליגניות מגוונות עבור משפחת הקולטן כמו אגרה עשוי להפעיל הפקות ספציפיות של EVs ב מיקרוגלייה26. לדוגמה, במחקרים חוץ גופית מראים כי lps-הופעל מיקרוגלייה BV2 תאים קווי לייצר תוכן EV דיפרנציאלי כולל הפרו-דלקתיות ציטוקינים27. לכן, המגוון הפונקציונלי של אוכלוסיות משנה של תאים חיסוניים ב-cn, מיקרוגלייה והחדירה bmdms, עשוי להיות מוערך דרך אוכלוסיות ev שלהם כולל ההשפעה EV על תאי הנמען וזיהוי של תוכן EV.

בעבר תיארנו שיטות כדי להעריך את המאפיינים הפונקציונליים של microglia-ו-bmdm נגזר EVs לאחר בידוהם16,19. בדוח הנוכחי, אנו מציעים להעריך באופן עצמאי את ההשפעה של microglia-נגזר EVs על neurite outgrowth, ואת ההשפעה של מקרופאג-נגזר EVs על השליטה של אגרגטים תא glioma. מחקר זה מציע גם ניתוח הפרוטאומית רחב של שברים EV כדי לאמת את ההליך בידוד EV, כמו גם לזהות את חתימות החלבון הפעיל ביולוגית. ההשפעות מועילות הפענוח המולקולרי של תוכן EV יכול לעזור מניפולציה אפשרי שלהם להשתמש כמו סוכנים טיפוליים בהפרעות במוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. התרבות הראשית של Microglia/מקרופאגים

  1. התרבות הראשית של מיקרוגלייה
    1. תרבות מסחרית חולדה מיקרוגליה ראשונית (2 x 106 תאים) (לראות את הטבלה של חומרים) ב-בינונית שונה של הנשר מאוד (dmem) שיושלם עם 10% אקסוזום הסרום, 100 U/mL של פניצילין, 100 μg/mL סטרפטומיצין, ו 9.0 g/L גלוקוז ב 37 ° c ו 5% CO2.
    2. לאסוף את המדיום הממוזג אחרי תרבות 48 h ולהמשיך לבידוד של EVs.
  2. התרבות העיקרית של מקרופאגים
    1. תרבות מסחרי חולדה הראשי מקרופאגים ראשוניים (1 x 106 תאים) במדיום המסופקים על ידי היצרן (לראות את טבלת חומרים) ב 37 ° צ' ו 5% CO2, עם הסרום אקסוזום חינם.
    2. לאסוף את המדיום הממוזג לאחר התרבות 24 h ולהמשיך לבידוד של EVs.

2. בידוד של EVs

  1. טרום בידוד של EVs מבינוני ממוזג
    1. העבר את מדיום התרבות הממוזגת מ-מיקרוגלייה או תרבויות מקרופאג (שלבים 1.1.2 או 1.2.2) לתוך צינור חרוט.
    2. צנטריפוגה ב 1,200 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי לצנפה את התאים.
    3. העבר את הסופרנטנט לצינור חרוט חדש. צנטריפוגה ב 1,200 x g עבור 20 דקות ב-RT כדי לחסל גופים אפוטוטיים.
    4. העבר את supernatant לתוך צינור פוליקרבונט 10.4 mL ולהעביר את הצינור לתוך הרוטור מ70.1 Ti. Ultracentrifuge ב 100,000 x g עבור 90 דקות ב 4 ° c כדי גלולה EVs.
    5. להיפטר supernatant ולהשעות את הגלולה המכילה EVs ב 200 μl של 0.20 יקרומטר מסוננים מאגר פוספט מלח (PBS).
  2. בידוד של EVs
    1. הכנת עמודת כרומטוגרפיה בגודל תוצרת בית (SEC)
      1. רוקן כרומטוגרפית זכוכית (אורך: 26 ס"מ; קוטר: 0.6 ס מ) (ראה את הטבלה של חומרים), לשטוף ולעקר אותו.
      2. הצב מסנן של 60 יקרומטר בתחתית העמודה.
      3. מחסנית העמודה עם מטריצה בסיס סינון ג'ל מקושרת בין העמודים ליצירת שלב נייח של קוטר 0.6 ס מ וגובה של 20 ס מ.
      4. לשטוף את השלב עם 50 mL של 0.20 יקרומטר מסוננים PBS. במקרה הצורך, ניתן להשתמש בחנות ב-4 ° צ'.
    2. הניחו את הגלולה EV הושעה מחדש על גבי השלב הנייח של העמודה SEC.
    3. לאסוף 20 שברים רציפים של 250 μl כאשר ממשיכים להוסיף 0.20 יקרומטר מסוננים PBS בחלק העליון של השלב הנייח כדי למנוע ייבוש של העמודה. אחסן את השברים ב-20 ° c במידת הצורך.
      הערה: אחסון ארוך יותר משבוע אחד ניתן לבצע ב-80 ° צ' כדי לשמור על תקינות EV לניתוח מולקולרי.
  3. מטריקס סייעה בניתוח הספקטרומטר המסה של השברים ב-SEC
    1. המשך לבידוד EV כמתואר בסעיף 2.2.
    2. להשעות מחדש את הגלולה EV עם 200 μL של פתרון ערבוב של כיול פפטיד (לראות את הטבלה של חומרים).
    3. המשך לאוסף EV כפי שמתואר בסעיפים 2.2.1 כדי 2.2.3.
    4. יבש לחלוטין את השבר עם מרכז ואקום.
    5. מרכיבים מחדש את השברים עם 10 μL של 0.1% החומצה trifluoroacetic (TFA).
    6. מערבבים 1 μL של שבר מחדש עם 1 μL של α-cyano-4-hydroxycinnamic חומצה (מטריצות) על צלחת פלדה MALDI מלוטש היעד.
    7. לנתח את כל השברים עם ספקטרומטר מסה של MALDI.
    8. ניתוח ספקטרום שנוצר עם תוכנה ייעודית (ראה טבלת חומרים).

3. אפיון EVs

  1. ננו-חלקיק ניתוח מעקב (נ. ת. ע)
    הערה:     ניתוח נ. ת. ע מבוצע עם מכשיר לניתוח מעקב ננו-חלקיק (ראה טבלת חומרים) ומשאבת מזרק אוטומטית.
    1. לעשות דילול (טווח של 1:50 עד 1:500) של כל שבר שניה משלב 2.2.3 עם 0.20 יקרומטר מסוננים PBS.
    2. מערבולת הפתרון כדי לחסל אגרגטים EV.
    3. לשים את הפתרון מדולל ב 1 מזרק mL ולמקם אותו משאבת מזרק אוטומטי.
    4. התאם את הגדרת המצלמה לרמת הרווח (3) ולרמת המצלמה (13).
    5. לחץ על הפעלה והפעל את הסקריפט הבא.
      1. העמיסו את המדגם בתא ניתוח (שיעור אינפוזיה: 1,000 עבור 15 s).
      2. הקטן והצב את זרימת המהירות להקלטת וידאו (שיעור אינפוזיה: 25 עבור 15 s). לכידת שלושה קטעי וידאו רצופים 60 s של זרימת החלקיקים.
      3. כוונן את רמת המצלמה (13) ואת סף הזיהוי (3) לפני ניתוח סרטי וידאו. לחץ על הגדרות | אישור כדי להתחיל את הניתוח ולחץ על ייצוא כאשר הניתוח מתבצע.
    6. בין כל ניתוח שבר, לשטוף עם 1 mL של 0.20 יקרומטר מסוננים PBS.
  2. ניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני (EM)
    1. בודד EVs כפי שמתואר בסעיף 2.
      הערה: אין צורך בתנאים סטריליים.
    2. חזור על סעיף 3.1 לכמת EVs.
      הערה: רק שברים חיוביים ישמשו עבור ניתוח EM.
    3. השתמש במסנן צנטריפוגלי 50 kDa (ראה טבלת חומרים) כדי לרכז שברים מכילים EV.
    4. השעיית מחדש מרוכז EVs ב 30 μL של 2% פאראמפורמלדהיד (בתחתית).
    5. טען 10 μL של המדגם אל רשת נחושת מצופה פחמן.
    6. דגירה של 20 דקות בסביבה רטובה.
    7. חזור על הצעדים ה3.2.5 וה3.2.6 לספיגה טובה של המדגם ברשת.
    8. להעביר את הרשת לתוך טיפה של 1% גלוטאלדהיד ב-PBS עבור 5 דקות ב-RT.
    9. לשטוף את המדגם עם מים באולטרסאונד מספר פעמים.
    10. בניגוד למדגם עבור 10 דקות על הקרח עם תערובת של 4% uranyl אצטט ו 2% מתילצלולוזה (1:9, v/v). הסרת עודפי התערובת באמצעות נייר סינון.
    11. נגב את המדגם ולהתבונן בו תחת מיקרוסקופ אלקטרוני שידור ב 200 kV (לראות את הטבלה של חומרים).
  3. אנליזה מערבית של כתמי אבן
    1. עקירת חלבון
      1. חזור על השלבים ה3.2.1 ל3.2.3 כדי לבודד ולרכז את EVs.
      2. מערבבים 50 μL של מאגר ריפה (150 מ"מ נתרן כלוריד [הנאל], 50 mM טריס, 5 מ"מ אתילן גליקול-bis (2-עמינח)-N, n, N, N′-הטטראצטט חומצה [EGTA], 2 מ"מ מתוך החומצה הטאצנבית [EDTA], 100 מילימטר נתרן פלואוריד [NaF], 10 מילימטר מנתרן פירופוספט, 1% Nonidet P-40, 1 מ"מ פנילמתיונין פלופקסיל [PMSF], 1x מעכב פרוטאז) עם מדגם EV (25 μL כתוצאה מריכוז EV על מסנן) עבור 5 דקות על הקרח כדי לחלץ חלבונים.
      3. Sonicate עבור 5 s (משרעת: 500 W; תדירות: 20 kHz), 3 פעמים על קרח.
      4. הסרת פסולת vesicular על ידי צנטריפוגה ב 20,000 x g עבור 10 דקות, ב 4 ° c.
      5. לאסוף את supernatant ולמדוד את הריכוז חלבון עם שיטת ברדפורד החלבון שיטה.
    2. Dodecyl סולפט נתרן פוליאקרילמיד ג'ל לג (SDS-PAGE) ובלוק מערבי
      1. מערבבים חלבון תמציות (30 μg) עם מאגר לדוגמה 5c Laemmli (v/v).
      2. העמיסו את תערובת החלבון ב-12% פוליאקרילאמיד ג'ל.
      3. להעביר את החלבונים ב ג'ל עם מאגר ה-, התכנית (25 מ"מ 8.5 Tris pH, 192 מ"מ גליצין, ו 0.1% SDS), ב 70 V עבור 15 דקות ו-120 V עבור 45 min.
      4. העבר את החלבונים אל ממברנה ניטרוצלולוזה עם מערכת חצי יבשה ב 230 V עבור 30 דקות.
      5. רוויה הקרום עבור 1 h ב RT עם חסימת מאגר (0.05% רצף 20 w/v, 5% אבקת חלב w/v ב 0.1 M PBS, pH 7.4).
      6. מעכלת את הקרום לילה ב 4 ° צ' עם העכבר מונושבטיים נגד האדם בהלם חום אנושי חלבון 90 (HSP90) הנוגדן מדולל במאגר חסימת (1:100).
      7. לשטוף את הקרום שלוש פעמים עם הערוץ הPBS (PBS, 0.05% רצף 20 w/v) עבור 15 דקות.
      8. מארג הממברנה עבור 1 h ב RT עם חזרת עז peroxidase-מעלה מעלה אנטי עכבר משני הנוגדן מדולל בתוך חסימת מאגר (1:10000).
        הערה: שליטה שלילית מבוצעת באמצעות נוגדנים משניים בלבד.
      9. חזור על שלב הכביסה (שלב 3.3.2.7).
      10. לחשוף את הקרום עם משופר כימובסנס (ECL) ערכת המצע בלוק מערבי (ראה טבלת חומרים).
  4. אנליזה פרוטאומית
    1. מיצוי החלבונים והעיכול בתוך ג'ל
      1. חזור על השלבים ה3.2.1 ל3.2.3 כדי לבודד ולרכז את EVs. חזור על שלב 3.3.1 עבור חילוץ חלבון EV.
      2. לבצע הגירה חלבון בערימת ג'ל של 12% פוליאקרילאמיד ג'ל.
      3. תקן את החלבונים ג'ל עם כחול coomassie עבור 20 דקות ב RT.
      4. בבלו כל פיסת ג'ל צבעוני וחותכים אותו חתיכות קטנות של 1 מ"מ3.
      5. לשטוף את חתיכות ג'ל ברציפות עם 300 μl של כל פתרון: מים אלקטרופורזה עבור 15 דקות, 100% acetonitrile (acn) עבור 15 דקות, 100 mM אמוניום ביקרבונט (NH4hco3) עבור 15 דקות, acn: 100 מ"מ NH4hco3 (1:1, v/v) עבור 15 דקות, ו 100% acn עבור 5 דקות עם ערבוב רציפה.
      6. יבש חתיכות ג'ל לגמרי עם מרכז ואקום.
      7. לבצע הפחתת חלבון עם 100 μL של 100 mM NH4hco3 המכיל 10 מילימטר dithioitol עבור 1 h ב 56 ° c.
      8. לבצע האלקיללציה חלבון עם 100 μL של 100 mM NH4hco3 המכיל 50 mm iodoamide עבור 45 מינימום בחשיכה ב-RT.
      9. לשטוף את חתיכות ג'ל ברציפות עם 300 μL של כל פתרון: 100 mM של NH4hco3 עבור 15 דקות, Acn: 20 מ"מ nh4hco3 (1:1, v/v) עבור 15 דקות, ו 100% acn עבור 5 דקות עם ערבוב רציפה.
      10. יבש לחלוטין את חתיכות ג'ל עם מרכז ואקום.
      11. לבצע עיכול חלבון עם 50 μL של טריפסין (12.5 μg/mL) ב 20 מ"מ NH4hco3 לילה ב 37 ° c.
      12. לחלץ את החלבונים מתעכל מן הג עם 50 μL של 100% ACN עבור 30 דקות ב 37 ° צ' ולאחר מכן 15 דקות ב-RT עם ערבוב רציפה.
      13. חזור על הליכי החילוץ הבאים פעמיים: 50 μL של 5% TFA ב 20 מ"מ NH4hco3 פתרון עבור 20 דקות עם ערבוב רציף.
      14. הוסף 100 μL של 100% ACN עבור 10 דקות עם ערבוב רציף.
      15. יבש חלבונים מתעכל עם מרכז ואקום ולהשעות מחדש 20 μL של 0.1% TFA.
      16. Desalt המדגם באמצעות טיפ 10 μl הפיפטה עם סי18 בשלב הפוך מדיה להתפלת ולהתרכז פפטידים (לראות את הטבלה של חומרים) ופפטידים elute עם acn: 0.1% החומצה פורמית (ה-FA) (80:20, v/v).
      17. יבש לחלוטין את המדגם עם מרכז ואקום ולהשעות מחדש 20 μL של ACN: 0.1% פא (2:98, v/v) עבור כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריה ספקטרומטר מסה (LC-MS/MS).
    2. ניתוח-MS/MS-מחקר
      1. טען את הפפטיד מתעכל לתוך כלי LC-MS/MS ולבצע דגימה וניתוח נתונים על פי פרמטרים המתוארים בפירוט במקום אחר42.
    3. ניתוח נתונים גולמיים
      1. עבד נתונים ספקטרומטר מסה כדי לזהות חלבונים ולהשוות חלבונים מזוהים של כל מדגם עם חבילת תוכנה פרוטאומניקס כמותית באמצעות פרמטרים סטנדרטיים.
      2. ייצוא, שימוש בפרמטרים סטנדרטיים, רשימה של חלבונים בלעדיים ומיוצגים מחדש מ-EV דגימות חיוביות בתוכנה חיזוי רשתות חלבונים ותהליכים ביולוגיים.
      3. השוו את רשימת החלבונים המזוהים בשברים עם החלק העליון 100 EV סמנים ממסד הנתונים הפתוח אקסוכרטה (לראות את הטבלה של חומרים).

4. שיטת השפעות EVs פונקציונלית

  1. Neurite מוצלח שיטת הצמיחה על PC-12 קו התא
    1. התרבות PC12 קו התא בינונית DMEM דיום מלאה (2 מ"מ L-גלוטמין, 10% סרום הסוס העוברי (FHS), 5% סרום בפרה העובר (FHS), 100 UI/משתמש/למשתמש הפניצילין, 100 μg/mL סטרפטומיצין).
      הערה: הסרה בחינם. בתהליך כולו
    2. להוסיף זכוכית כיסוי (כל הבארות) לצלחת 24-טוב; מעיל את הצלחת עם פולי-D-ליזין (0.1 mg/mL) ו seed 260,000 תאים/גם.
    3. מודיית את התאים ב 37 ° c תחת 5% CO2.
    4. לאחר 24 שעות של דגירה, לשנות את המדיום לבידול dmem דיום בינונית (dmem עם 2 מ"מ L-גלוטמין, 0.1% fhs, 100 UI/ml פניצילין, 100 μg/ml סטרפטומיצין) עם 1 x 106 מיקרוגלייה EVs (משלב 1.1.2).
      הערה: תנאי הבקרה מבוצע ללא מיקרוגלייה EVs במדיום בידול.
    5. ביום 4 לאחר זריעה, לטעון את כל הבארות עם 100 μL של מדיום מלאה DMEM.
    6. ביום 7 לאחר זריעה, לתקן את התאים עם 4% בכיוון הערוץ 20 דקות ב RT ולשטוף שלוש פעמים (10 דקות כל אחד) עם PBS.
    7. הכתם את התאים עם מעלה מעלה phalloidin עבור 30 דקות ב 4 ° צ' ולשטוף 3 פעמים (10 דקות כל אחד) עם PBS.
    8. כתם את התאים עם מדולל Hoechst 33342 (1:10000) עבור 30 דקות ב RT ולשטוף 3 פעמים (10 דקות כל אחד) עם PBS.
    9. הבהר את זכוכית המכסה בשקופית עם הרכבה בינונית (ראה טבלת חומרים).
    10. לנתח את השקופית עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, לקחת 5 תמונות אקראיות של כל שקופית.
    11. מדידת neurite מוצלח באמצעות תוכנת קוונפיקציה אוטומטית (סה כ neurite אורך) כפי שמתואר בפירוט במקום אחר43.
  2. Neurite מוצלח על הנוירונים הראשי חולדה
    1. מעיל a 8-הבאר זכוכית שקופית עם פולי-D-ליזין (0.1 mg/mL) ו-למינציה (20 μg/mL).
    2. התרבות עכברוש מסחרי הנוירונים הראשי במדיום התרבות המתאימה (ראה טבלת חומרים) על ידי ציפוי 50,000 תאים לכל טוב והוא דגירה את התאים ב 37 ° צ' תחת 5% CO2 עבור 48 h.
      הערה: . ההליך הינו חופשי בתהליך כולו
    3. הוסף 1 x 106 מיקרוגלייה EVs כדי בינוני תרבות העצב ו דגירה ב 37 ° צ' תחת 5% CO2 עבור 48 h יותר.
      הערה: תנאי הבקרה מבוצע ללא מיקרוגלייה EVs במדיום תרבות העצב.
    4. בצע את השלבים 4.1.6 כדי 4.1.9 לתקן ולהכתים את התאים.
    5. בצע את השלבים 4.1.10 ו-4.1.11 כדי לנתח את השקופית.
  3. הפלישה לתאים glioma
    1. השעיה מחדש C6 בתאי glioma עכברוש בינונית DMEM דיום מלאה (DMEM עם 10% FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין, 1x אנטיביוטיקה) המכיל 5% קולגן בריכוז הסופי של 8,000 תאים ב 20 μL.
      הערה: . ההליך הינו חופשי בתהליך כולו
    2. מקום 5 מ ל של PBS בתחתית הצלחת התרבות 60 מ"מ הרקמה. היפוך המכסה ואת טיפות הפקדה של 20 μL (8,000 תאים) של התא ההשעיה על החלק התחתון של המכסה.
    3. היפוך המכסה על החדר התחתון ממולא PBS ו מודקת את הצלחת ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 72 h עד spheroids התאים נוצרות.
    4. הוסף 1 x 108 מקרופאג EVs (משלב 1.2.2) כדי 2.2 Mg/ml תערובת קולגן (2 מ ל של סוג קולגן של שור אני פתרון [3 מ"ג/ml] עם 250 μl של 10x בינוני חיוני מינימלי (זיכרון) ו 500 μl של 0.1 M נתרן הידרוקסיד).
      הערה: תנאי הבקרה מבוצע ללא מקרופאג EVs בתערובת הקולגן.
    5. הפץ את תערובת הקולגן המכילה EVs בצלחת 24-היטב להטבעת spheroids תאים.
    6. השתל את מספרי הטלפון החדשים שנוצרו במרכז כל באר.
    7. מודקת את הצלחת 30 דקות ב 37 ° צ' ו 5% CO2 כדי לחזק את ג'ל.
    8. לאחר מכן, כיסוי 400 μL של מדיום מלאה DMEM על מטריצת הקולגן בכל באר.
    9. מודטה את המערכת המלאה עבור סך של 6 ימים ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
      הערה: הפלישה התא מחוץ ספרואיד הוא מנוטר על ידי צילום דיגיטלי באמצעות מיקרוסקופ אור הפוכה באמצעות מטרה 4x/0.10 N.A..
    10. השיגו תמונות של כל. אחד מהם כל יום
    11. לעבד תמונות ולכמת הפלישה של אזורי תא ספרואיד באמצעות התוכנה כפי שתוארה בעבר בפירוט42.
      הערה: הפלישה ואזורים ספרואיד היו מנורמל עבור כל יום לפלישה ואזורים ספרואיד למדוד ביום 0.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אחד האתגרים העיקריים לייחוס השפעות ביולוגים לEVs ושלפוחיות (מידה) היא היכולת לבודד את EVs מתוך מדיום התרבות כולה. בדוח זה, אנו מציגים שיטה המשתמשת בשיטת ultracentto (UC) וגודל כרומטוגרפיה להדרה (SEC) אשר מצמידים לניתוח בקנה מידה גדול של חתימות חלבונים כדי לאמת סמנים EV ולזהות תרכובות אקטיביים. מקרופאג-או microglia-נגזר EVs מבודדים מן המדיום הממוזג לאחר התרבות 24 h או 48 h בהתאמה (איור 1).

Figure 1
איור 1: האוסף ואסטרטגיות הבידוד של מסחטות (EV). הגופים האפוטוטיים והריסות התאים הופרדו מהמדיום-או המקרופאג הממוזג באמצעות צעדים רצופים צנטריפוגה. מתוך הסופרנטנט, EVs הייתה מבודדת על-ידי הסתבכות באמצעות ה-UC. הגלולה של ה-UC המכילה את EVs נטענה על העמודה ומופרדת באמצעות כרומטוגרפיה של החרגת מגודל (SEC) ב-20 שברים שונים. כפי שנחשף בשלבים נוספים (מיקרוסקופ אלקטרוני, ניתוח מעקב ננו-חלקיק וניתוח פרוטאומית), שברי שניות היו מאורגנים ומאורגן ל-1F-EV-, 2F-EV + ו-3F-EV-. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

השיטה הלכה בעקבות שלבים צנטריפוגה רצופים: הראשון להסיר את התאים והשני כדי להסיר את הפסולת התאית וגופים אפוטוטיים. לאחר מכן, הסופרנטאנט הועבר לצינור חדש כדי לבצע הארכה של 100,000 x g עבור 90 דקות. השלפוחיות נאספו יחד עם אגרגטים חלבון בתוך הגלולה הסופית של ה-UC. עמודת SEC שימש להפרדת התרכובות בהתאם לגודלם ולהסרת האגרגטים (איור 1). על מנת לאשר את הבידוד של EVs, כל שבר שניה עקב אחר ניתוח מעקב ננו-חלקיק (איור 2A).

Figure 2
איור 2: ניתוח השברים של SEC. (A) ננו-חלקיק ניתוח מעקב (נ. ת. ע) של שברים של SEC. מספר החלקיקים הכולל בכל שבר של SEC מוצג עם תרשימי עמודות. תרשימי הסרגל הכתום מציגים את שלושת החלקים הרצופים של EV + (F5 – F7). (ב, ג) לכידות מסך של נ. ת. ע מראה הבדלים משמעותיים בזרימת החלקיקים בין שברים SEC. (ד) אנליזה משלימה של מיסת מאלדי. מגלולה אחרת של UC המכילה EVs, ערכת פפטיד בקרה סטנדרטית נוספה לפני הפרדת SEC כדי לאמת את הביצועים של האסטרטגיה SEC. כל שבר שניה נותח עם מטריקס בסיוע לייזר ליינון-זמן טיסה (MALDI-תוף) כדי לקבוע שברים סטנדרטיים-חיוביים. ב -9 הספקטרום הראשון (שברים 1 עד 9), לא נצפתה אות. האיתור של תקנים חופשיים אלה היה אפשרי בשברים הבאים (שברים 10 עד 20) המאשרים את היכולת של הליך שניה להפריד בין EVs (F5-F7) מרכיבים מסיסים (F10 – F20). (E) ניתוח כתמי צבע מערבי של שברים של SEC כניתוח ראשוני של סמן EV. EV + שברים (F5 – F7) היו במאגר כמו מדגם אחד (2F-VE +) בעוד EV שברים (F1 – F4 ו F8 – F20 בהתאמה) היו ממאגר שתי דגימות אחרות בשם 1F-EV-ו-3F-EV-. התוצאות הראו את הנוכחות של חלבון הלם חום 90 (HSP90) (EV חיובי סמן) אות ב 2F-EV +, וגם בתא lysate כמו שליטה חיובית, לעומת שברים אחרים (1F-EV-ו-3F-EV-). (F, G) ניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של מדגם EV חיובית (2F-EV +). התצפית מתחת לשני האגנים הרצופים חשפה את נוכחות EVs בטווח גודל סביב 100 ננומטר (חיצים לבנים) ובסביבות 400 ננומטר (ראש חץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מספר החלקיקים היה גבוה באופן משמעותי בשברים 5, 6 ו -7 מאשר הקודם (F1 – F4) ואלה הבאים (F8 – F20). ניתן היה לראות זרימה של חלקיק בשברים אלה גם אם מספר חלקיקים נצפו בשברים הבאים (איור 2ב, ג). הפרדה זו אינה מונעת את האפשרות ששברים שונים מ-F5 – F7 עשויה להכיל כמות קטנה של שלפוחיות, או אפילו כי EV-עשיר שברים F5 כדי F7 עשוי להכיל מזהמים מולקולריים. כדי להבטיח לפחות את שברים F5-F7 הם חופשיים של מולקולות מזהם שכונתיות, זה היה הכרחי לעקוב אחר מסלול הזמן הימנעות של תרכובות שונות בהליך SEC. לשם כך, השליטה בתקני הפפטיד נוספו לגלולה של UC דומה כפי שהייתה בשימוש קודם. הכנה זו הייתה מופרדת שוב באמצעות הליך SEC. לאחר מכן, מטריקס סייעה בספיחה לייזר – זמן הטיסה (MALDI) ניתוח ספקטרומטר המסה בוצע על מנת לזהות את שברי השניות שבהן התקבצו התקנים (איור 2D). בשל היקף המסה, בניתוח זה הופעלו רק מוצרים מתוצרת משלו מתקני פפטיד. התוצאות הראו כי מוצרים אלה נחשפו בשברים 10 כדי 20, הוכחת כי כל חלבון מסיסים לא ניתן להתחמק באותם שברים כמו EVs (F5 – F7). תוצאות אלה אישרו את האינטרס של גישה זו בהפרדה של EVs מתוך רכיבים שאינם EV. אפילו בהנחה כי F8 – F20 שברים יכול להכיל שרידי חלק של EVs, החלטנו בניסויים הבאים כדי לשלב את השברים EV חיוביים (F5 – F7) במדגם אחד בשם 2F-EV +. כמו כן, שילבו את שני שברים אחרים לשתי דגימות בשם 1F-EV-(F1 – F4) ו 3F-EV-(F8 – F20). אנו מקובצים בשלוש דגימות מכמה סיבות. ראשית, מספר השברים של SEC יגביר את זמן הניתוחים המולקולריים, אך גם במחקרים בעלי מבחנה. EV-חיובית SEC שברים בנפרד מספרים חלקיק נמוך וגם להתפשר על גילוי תרכובות מולקולריות. באותו אופן, הוא נחשב יותר מתחשב כדי לקבץ את השברים F8 – F20 להתרכז, במידת הצורך, שרידי שלפוחיות ולבדוק את נוכחותם על ידי ניתוח כתמי מערבית ראשונית נגד HSP90, סמן EV. מעניין, אות חיובי עבור HSP90 התגלתה בשבר 2F-EV +, גם תא למטה כמו שליטה חיובית, אבל לא ב-1F-EV-ו 3F-EV-דגימות (איור 2F ו איור המשלים S1 כפקד). ניתוח זה מאשר את האינטרס של 2F-EV + בלבד והניהול הנכון של השברים הקודמים של SEC. כדי לאשר EV בידוד, ניסוי נוסף באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני ניתח רק 2F-EV + מדגם מותר התבוננות של EVs עם מורפולוגיה טיפוסית וגודל טרוגניות בין 100 ו 400 nm (איור 2F, G).

שלב מפתח נוסף באימות היה ניתוח פרוטאומית (איור 3). פיתחנו מחקר ספקטרומטר המסה שלמה עם יעדים מרובים: (אני) לאשר את הבידוד של EVs עם זיהוי של מספר גבוה של סמנים EV ב 2F-EV +, (ii) בסופו של דבר לזהות חלבונים זיהום ב EV דגימות שליליות (1F-EV-ו-3F-EV-) ו (iii) לאפיין את תוכן החלבון של

Figure 3
איור 3: ניתוח פרוטאומית של ev-חיוביים ו-ev-שלילי דגימות. (א) לאחר שלושה בדלתים עצמאיים EV ההכנות של תאים מיקרוגליה דומה, הדגימות 1f-ev-, 2f-ev + ו 3f-ev-היו טעונים נתרן dodecyl סולפט אלקטרופורזה ג'ל אלקטרופורזה (sds-PAGE) ו הועברו עד הערימה ג'ל לרכז חלבונים כדי להגשים את העיכול שלהם ב-gel. הפפטידים שנוצרו לאחר מכן נותחו על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריה המסה (LC-MS/MS) כדי לזהות את החלבונים המתאימים. (ב) השוואה בין החלבונים המזוהים בין דגימות 1F-ev-ו-2F-ev + מציג חלבונים נפוצים בשני השברים (19) וחלבונים שאותרו באופן בלעדי ב-2f-EV + שבר (522). מפת החום מראה את הייצוג היחסי שבו כל החלבונים הנפוצים בין 1F-EV-ו 2F-EV + טריפליטים היו מיוצגים מעל (אדום) ב-2F-EV + דגימות. (ג) השוואה בין חלבונים מזוהים בין שברים 2f-Ev + 3F-ev-מציג חלבונים משותפים בין טריליטים (113) ומיוצגים בלעדית חלבונים (428 ב 2F-ev + ו -11 ב 3F-ev-). מפת החום מציגה את הייצוג היחסי בשני אשכולות. אחד (אשכול A) מציג 5 חלבונים מעל המיוצגים ב-3F-EV-מדגם ושנייה (אשכול B) מציג 108 המיוצגים על ידי חלבונים ב-2F-EV +. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מתוך מדיה ממוזגת, ההליך UC ושניה הובילו לשלוש דגימות 1F-EV-, 2F-EV + ו-3F-EV-. החלבונים המתאימים חולצו ומרוכזים על ידי נתרן dodecyl סולפט אלקטרופורזה ג'ל אלקטרופורזה (sds-עמוד). לאחר הגירה קצרה בתוך הערימה, הדגימות נאספו על ידי כריתה של הלהקה, הועברה בצינורות שונים כדי להיות ב-ג'ל מתעכל. המוצרים הופרדו באמצעות כרומטוגרפיה מקוונת של שלב היפוך ישירות באמצעות ספקטרומטר מסה לניתוח (איור 3A).

התוצאות הבאות, כדוגמה של ההליך כולו, הושגו מדיום ממוזג מיקרוגליה לאחר תרבות 48 h. הנתונים הגולמיים הוגשו. למאגר חלבון של עכברים החלבונים המזוהים הושוו בין דגימות 1F-EV-ו-2F-EV + (איור 3B) ובין הדגימות 2f-ev + ו-3B-ev-(איור 3b). בהשוואה הראשונה, דיאגרמת הקבוצות הראתה 19 חלבונים נפוצים בשני השברים ו-522 חלבונים המזוהים באופן בלעדי בשבר 2F-EV +. הניתוח באמצעות תוכנת פרוטקומניקס כמותית אפשרה זיהוי של הייצוג היחסי של החלבונים המשותפים. התוצאות הראו מפת החום שבו כל החלבונים הנפוצים בין 1F-EV-ו 2F-EV + טריפליטים היו מעל מיוצגים (אדום) ב 2F-EV + דגימות. בהשוואה השנייה בין שברים 2F-EV + ו 3F-EV-, 113 חלבונים נפוצים זוהו בין מטריליטים. יתר על כן, 428 חלבונים זוהו באופן בלעדי ב-2F-EV + ו -11 חלבונים נמצאו באופן בלעדי ב 3F-EV-. בעקבות האנליזה הכמותית, הצגת מפת החום של 113 החלבונים המשותפים המסומנים בשני האשכולות שבהם האשכול הציג חמישה חלבונים בעלי ייצוג מיותר ב-3F-EV-מדגם והאשכול B הציג 108 יותר מאשר החלבונים מיוצגים ב-2F-EV +.

428 חלבונים המיוצגים באופן בלעדי ו 108 חלבונים מעל מיוצגים ב-2F-EV + הוגשו למסד הנתונים הפתוח אקסוקרטה כדי לזהות מולקולות הקשורות EV. הניתוח של העליון 100 EV סמנים ב אקקרטה הדגיש את הנוכחות של 86 EV הקשורים חלבונים ב 2F-EV + (איור 4A).

Figure 4
איור 4: ניתוח חלבונים מדגם 2F-EV +. (א) בריכה של 536 חלבונים (428 בלעדית ו108 מעל המיוצגים חלבונים) הוגשה למסד הנתונים אקסוקרטה כדי לזהות מולקולות הקשורות EV. מולקולה סמלים של 86 EV-הקשורים חלבונים שאותרו בראש 100 מסמנים EV ממסד הנתונים אקסוכרטה. (ב) החיזוי של אינטראקציות חלבונים וההתאגדות שלהם לתהליכים ביולוגיים נבחרים הראו מסלולים החיסונית ונוירוהמגן במדגם 2f-EV +. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מעניין, ניתוח של 5 החלבונים המשותפים באשכול A ו -11 החלבונים המיוצגים בלעדית ב-3F-EV-לא היו קשורים סמן EV (נתונים לא מוצגים). לבסוף, החיזוי של אינטראקציות חלבונים והקשר שלהם עם תהליכים ביולוגיים נבחרים הראה את הנוכחות של 2F-EV + חלק של המגשרים החיסונית (21%) מעורב לעיתים בשליטה על התגובה הדלקתית (4.1%) (איור 4B). תוכן EV ב-2F-EV + היו קשורים גם הפיתוח העצבי (16.8%), בידול תא העצב (5%) והשליטה על מוות עצבי (3.8%) שהוא בהתאם לneurite מוצלח שלהלן.

לפיכך, האסטרטגיה שאנו בחרנו מאפשרת את הגישה של כל הנתונים ומאפשרת חיזוי של פונקציות EV-תיווך לפני העשור הביולוגי שאנו מתבצעים לאחר מכן (איור 5).

Figure 5
איור 5: מתוך הספר התלוי ב-EV. ההשפעות של microglia-נגזר EVs הוערכו על neurite מוצלח (המסגרת העליונה) ואת ההשפעות של מקרופאג-נגזר EVs הוערכו על הפלישה תא glioma (המסגרת התחתונה). (א, ב) אורך neurite נמדד על התאים PC-12 (פאנל A השתנה מ-רפלo-רומרו ואח '16 עם הרשאה) או נוירונים ראשוניים חולדות (ב). התוצאות הראו עלייה משמעותית בהגדלת הגדילה תחת EVs (+ EVs) לעומת השליטה (Ctrl). סרגל בקנה מידה = 20 μm. (ג, ד) זמן קורס של הפלישה C6 glioma ספרואיד לתוך קולגן בנוכחות של עכברוש ראשי מקרופאג-נגזר EVs (c6 + EVs) או רכב (c6 בקרת). הפלישה C6 ספרואיד 3D לתוך קולגן היה במעקב וכימות עד 6 ימים. קוונפיקציה של הפלישה תא הגידול מוצגים 1, 2, 3 או 6 ימים (ג) כפי שנצפו על תמונות ייצוגית (ד). סרגל קנה מידה = 500 μm. עבור neurite מוצלח assays, המשמעות חושבה על-ידי מבחן tמזווג סטודנט (* p < 0.05, * * p < 0.01 ו * * * p < 0.001). לצורך שיטת הפלישה, המשמעות חושבה על-ידי ANOVA בכיוון אחד ואחריה מבחן הדואר של Tukey. קווי השגיאה מציינים שגיאת תקן יחסית של שלושה ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

בדרך זו, פונקציות neurotrophic של microglia-נגזר EVs נחקרו על PC-12 קו התא ונוירונים הראשי חולדה. התוצאות הראו השפעה חיובית על neurite מוצלח (איור 5א, ב). הנוכחות של EVs בהתאמה עלה על 6 ו 1.5 לקפל את הרשת neurite באורך ו/או במספר ב PC-12 ואת הנוירונים העיקריים בהשוואה למצב בקרה. בהקשר אחר, אנחנו גם למדנו את ההשפעות של מקרופאג נגזר EVs על הפלישה גידול במוח (איור 5C, D). הוא הוערך באמצעות spheroids הגידול 3D מוטבע מטריצה של קולגן. Spheroids שנוצר עם התאים C6 עכברוש glioma היו תרבותיים עבור 6 ימים במטריקס קולגן המכיל (או לא מכיל) EVs מטוהרים ממדיום התרבות מקרופאגים החולדה. מטריצת קולגן מספק מבנה שבו תאים סרטניים יכולים לפלוש ולהתפשט מתוך הספרואיד. EVs מקרופאג הנגזרים לקויי הצמיחה והפלישה של glioma הפליאידים. לאחר שישה ימים של תרבות, הירידה 50% של הפלישה נצפתה ב-EV-הרורואידים שטופלו לעומת השליטה. תוצאה זו הראו כי מקרופאגים יכולים לייצר EVs עם אנטי-tumoral ו/או אנטי פולשנית גורמים המשפיעים על הצמיחה glioma.

Supplementary Figure S1
איור משלים S1: תמונות של הקרום המשמש לניסוי בלוכי מערבי. (א) התמונה המקורית של הכתם המערבי מאיור 2e (נגד HSP90 EV סמן). (ב) פוננסו מכתים את התמונה של הממברנה אותו מראה את הטעינה הנכונה של תמציות חלבונים מ-1F-ev-, 2F-ev + ו-3F-ev-דגימות. אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מערכת העצבים המרכזית (CN) היא רקמה מורכבת שבה תקשורת תא לתא מסדיר פונקציות נוירואליות נורמליות הדרושות לומאוסטזיס30. EVs הם כיום נחקרו נרחב ותיאר מטענים מולקולרי חשוב עבור תקשורת תא אל התא31. הם מעבירים במפורש קוקטייל של מגשרים לתאי המקבל ומשפיעים על התפקודים שלהם בתנאים בריאים ופתולוגיים32. מחקרים שנעשו לאחרונה עולה כי EVs לשחק תפקיד מכריע במערכת ה24,33,34 ובמיוחד אלה מתאי החיסון המוח35,36. האיזון בין תגובות החיסון pro-אנטי דלקתית הוא קריטי ומאפשר לשמור על שלמות המוח במהלך התפתחות סינפטית ופעילויות עצביים ברחבי החיים. שני מצבים שונים של תגובות החיסונית נדונו במחקר זה: הקשר (אני) בין מיקרוגלייה ונוירונים ו (ii) בין הסתננות מקרופאגים ו glioma תאים. ראשון, מיקרוגלייה הם מקרופאגים המתמחים ברקמת המוח שבו הם משחקים תפקיד מפתח החיסונית בניהול שינויי מיקרוסביבה כדי להבטיח את הפעילות העצבית. אבל מנגנונים pro-דלקתיות מוגזמת ניתן לתמוך על-ידי מיקרו מופעל על ידי מיקרוגלייה ולהוביל הפרעות ניווניות37,38. לעומת זאת, gliomas בדרגה גבוהה דורשים פרופילים אנטי דלקתיות וכרוכים הגידול משויך מקרופאגים (TAMs) גויס באתר הגידול. מח העצם נגזר מקרופאגים (BMDMs) מייצגים אוכלוסייה גדולה של TAMs אלה ביחס קרוב עם תאים glioma. תחת השפעת הגידול, BMDMs מוצג vivo אנטי דלקתיות ו pro-tumoral וסרי פרופילים39. כיצד BMDMs אלה יכולים לשלוט בפלישה מחוץ לבית מתורבת הפריצה היא שאלה קריטית בדו ח זה. לכן, מקרופאג נגזר EVs שימשו לבד בשנת הפלישה glioma ספרואיד. ביחד בתרבות שיתוף, התאים glioma היה משפיע על מקרופאגים כדי לייצר אוכלוסיות EV אחרות עם פרופילים אנטי דלקתיות. השימוש הישיר של EVs החיסונית יכול להיות הרבה יותר טוב כמו סוכן אנטי-טומוראלי. כתוצאה מכך, תאי החיסון שומרים על תקשורת סלולרית לתאים במיקרו-סביבות מסוימות בהן האיזון הדלקתי מושפע מאוד מאותות חיצוניים40,41. ההבנה של התגובות החיסונית EV-תיווך מייצג אתגר גדול כדי להגביל את הפתוגנזה של הפרעות רבות. הזיהוי של התוכן הפעיל ביולוגית EV הוא אחד המפתח כדי להבין תהליכים דלקתיים מוסדר ולהציע אסטרטגיות טיפוליות חדשות42,43.

במחקר זה אנו מציגים מתודולוגיה המורכבת בתהליך הדיפרנציאלי הדיפרנציאליות כצעד הראשון לחסל את הפסולת התא, הגופים האפוטוטיים ומולקולות מסיסים, בשילוב עם כרומטוגרפיה הדרה בגודל לבודד EVs מפני אגרגטים מולקולריים. כאשר אוכלוסיית EV הם העריכו ביולוגי assays, זה חיוני להפלות את תוכן EV מחומרים אחרים מבודדים. לכן שיפרנו את הבידוד כדי להפריד EV-מן תרכובות שאינן הקשורות EV. על-ידי הוספת חלבונים סטנדרטיים בדגימות שליטה שהוגשו לנוהל SEC, היינו אז מסוגלים להתאים את השברים שלהם על ידי MALDI-תוף. בגלל הסטנדרטים הם מולקולות חינם, הם באופן גלובלי שיתוף עם מדגם מקושרות מולקולרית אגרגטים הקשורים לחומרים שאינם EV. לפיכך, שברי EV מדגימות ניסיוני אומתו בהליך בידוד אמין. בנוסף, פיתחנו אסטרטגיה כפולה הניתוח הפרוטאומית. מלבד השימוש של הנוגדן anti-HSP90 על ידי בלוק המערבי כמו מקדמי סמן EV זיהוי ראשוני, החלטנו לאמת את השבר EV הנכון על ידי זיהוי לא ממוקדות של חתימות הקשורות לחלבון EV. אכן, הגישה הנוכחית לא התמקדה בכוונה על זיהוי של סמנים מרובים EV ידוע בגלל הספציפיות מספיק רגישות של נוגדנים מסוימים. השונות והשפע של כמה סמנים EV על פני השטח של האוכלוסיות EV עדיין שנויים במחלוקת בהליכי בידוד. יתר על כן, מתודולוגיה מבוססת נוגדן יכול לייצג מגבלה במספר גבוה של אורגניזמים בשל חוסר נוגדנים מסחריים בעוד מחקרים EV הם עכשיו נושא חם בביולוגיה. זה ניתוח שאינו ממוקד מאפשר זיהוי של מספר גבוה יותר של מולקולות אשר כבר תוארו כמו סמנים EV (86 חלבונים בחלק העליון 100 הסמנים EV ממסד הנתונים אקסוכרטה). בסופו של דבר, גישה זו יכולה להיות באמת שימושי כדי לאמת את בידוד EV מפני אורגניזמים מתוארים גרוע בתנאי כי חלבונים שזוהו יכול להציג הומווגיות משמעותיות כדי הידוע סמנים EV. כפי שמתואר לאחרונה, ניתוח הפרוטאומית גדול יכול להיות חלופה לשימוש רק כמה סמנים שרירותיים43. זה ישפר את האפליה של שברים EV + ואת הזיהוי של התוכן הפעיל שלהם לפני השימוש בassays ביולוגי.

אכן, יש צורך לשייך את האפיון של תכני EV להשפעות שנצפו בספר ביולוגי. אכן, ההשפעה הביולוגית של EVs לתאי המקבל מציעה המגשרים ומגשרים הקשורים להיות מעורבים. שוב, אותו ניתוח שאינו ממוקד מאפשר זיהוי של מולקולות פעיל ביולוגית. מיטוב אפשרי בניתוח זה מדאיג את סוגי המולקולות שניתן לזהות. האסטרטגיה שלנו התבססה על ניתוח גדול של חתימות חלבונים והובילו מסלולים ביולוגיים חזוי הקשורים לתגובה החיסונית הישרדות העצב. חיוני לשקול את משפחות המולקולה האחרות כולל שומנים, mRNA ו-microRNAs למשל. המחקרים הנוכחיים שלנו משייכים את הזהויות הנוספות הללו לחתימות החלבון כדי לקבל ידע גלובלי של תקשורת זו התלויה ב-EV.

גישות טיפוליות רבות מואבות בשנים האחרונות. בהינתן כי EVs מסוגלים בקלות לחצות את מחסום מוח הדם ולהגיע לרקמות הפתולוגיים, אלה מטענים מולקולרי יכול לשמש בדרכים שונות. למרות מחקר זה לא להדגיש את מולקולות משטח EV, הזיהוי שלהם עדיין הכרחי כדי להבין טוב יותר את תהליך הטיפול לעבר תאים ורקמות היעד. הניתוח הפרוטאומית במתודולוגיה שלנו מעניק גישה לנתונים אלה. אחרת, בדוח זה, הצגנו בייצור מתורבת של EVs כקוקטיילים מועילים. לא הצלחנו לייעל את התנאים הטובים ביותר לפריים או להפעיל את התאים החיסוניים מראש. נקודה זו היא חיונית כי, ברקמות, מיקרואקולוגיה יש השפעה ישירה על התאים החיסוניים ובסופו של דבר תורמת לעיצוב biogenesis של EVs שלהם. במקרה של גלינובלסטומה למשל, זה נמצא כי התאים הסרטניים לייצר EVs שלהם, ובכך לתרום כדי להתמצא tams השכנה לכיוון פרופילים אנטי דלקתיות ודיכוי החיסונית המקומית שלהם44,45. זוהי הסיבה מדוע מקרופאג נגזר EVs בסביבה glioma שונים מאלה המיוצרים בתרבות מקרופאג אחת. כך, אנו ישירות בשימוש מקרופאג-נגזר EVs, בנפרד המיוצר מן התרבות מקרופאג יחיד, כדי לשלוט הפלישה גלימא ספרואיד כי מקרופאג-glioma שיתוף תרבות אין שליטה על גידול הגידול. אסטרטגיות טיפוליות נוספות יכול למנוע את זה בדיכוי vivo חיסוני באמצעות pro-דלקתיים ו anti-tumoral EVs המיוצר מחוץ לתחום מקרופאגים מופעלים. אסטרטגיה דומה יכול לשמש בהקשר של מחלות ניווניות באמצעות שימוש EVs נגזר מיקרוגלייה כראוי הודיע לייצר תגובה נוירומגן ואנטי דלקתיות להעדיף את ההישרדות העצבית. לסיכום, המחקרים של התקשורת EV-תיווך בין תאים חיסוניים לבין vivo מיקרוסביבה הם המפתח כדי לאפשר הבנה טובה יותר של פתוגנזה ועיצוב גישות טיפוליות חדשניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

העבודה המוצגת הייתה נתמכת על ידי המיניסטייר דה ל'חינוך הלאלה, דה L'Enseignement, et la Recherche ו-INSERM. אנו מכירים בהכרת העיר במרכז המדעי בקמפוס לגישה למכשירים ועצות טכניות. אנו מכירים בהכרת ז'אן-פסקל גיסימנו, Soulaimane Aboulouard ואיזבל פורנייר לסיוע בספקטרומטר המסה. אנו מכירים בהכרת הערב את טאננה הערבי, כריסטול ואן קאמפ, פרנסואז le Marrec-Croq, יאקופו ויזייולי ופייר-אריק סוטיץ ' על תרומתו החזקה להתפתחויות המדעיות והטכניות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-rad 4561045EDU  
Acetonitrile Fisher Chemicals A955-1  
Amicon 50 kDa centrifugal filter Merck UFC505024  
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830  
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) Santa-cruz sc-13119  
B27 Plus supplement Gibco A3582801  
BenchMixer V2 Vortex Mixer Benchmark Scientific BV1003  
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) Bio-Rad 5000006  
C18 ZipTips Merck Millipore ZTC18S096  
C6 rat glioma cell ATCC ATCC CCL-107  
Canonical tubes Sarstedt 62.554.002  
Centrifuge Eppendorf 5804000010  
CO2 Incubator ThermoFisher    
Confocal microscope LSM880 Carl Zeiss LSM880  
Cover glass Marienfeld 111580  
Culture Dish (60 mm) Sarstedt 82.1473  
Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819  
DMEM Gibco 41966029  
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph ThermoFisher    
Electron microscope JEM-2100 JEOL    
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich 03777-10G  
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich ED-100G  
Exo-FBS Ozyme EXO-FBS-50A-1 Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)     http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine Serum Gibco 16140071  
Fetal Horse Serum Biowest S0960-500  
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001  
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe Fisherbrand 12893543  
FlexAnalysis Brucker    
Fluorescence mounting medium Agilent S3023  
Formic Acid Sigma-Aldrich 695076  
Formvar-carbon coated copper grids Agar scientific Ltd AGS162-3  
Glucose Sigma-Aldrich G8769  
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich 340855  
Hoechst 33342 Euromedex 17535-AAT  
Idoacetamide Sigma-Aldrich I1149  
InstantBlue Coomassie Protein Stain Expedeon ISB1L  
Invert light microscope CKX53 Olympus    
L-glutamine Gibco 25030-024  
LabTek II 8 wells  Nunc 154534  
Laemmli 2x Bio-Rad 1610737  
Laminin Corning 354232  
MaxQuant software (proteins identification software)     https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stell Brucker 8268711  
MEM 10x Gibco 21090-022  
Methylcellulose Sigma-Aldrich M6385-100G  
MiliQ water Merck Millipore    
Milk Regilait REGILAIT300  
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 1658000FC  
MonoP FPLC column GE Healthcare   no longer available
Nanosight NS300 Malvern Panalytical NS300  
NanoSight NTA software v3.2 Malvern Panalytical    
NanoSight syringe pump Malvern Panalytical    
Neurobasal Gibco 21103-049  
Nitrocellulose membrane GE Healthcare 10600007  
Nonidet P-40 Fluka 56741  
Nunc multidish 24 wells ThermoFisher 82.1473  
Paraformaldehyde Electro microscopy Science 15713  
PC-12 cell line ATCC ATCC CRL-1721  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122  
Peptide calibration mix LaserBio Labs C101  
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-035-003  
Perseus software (Processing of identified proteins)     https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate Santa-cruz sc-362065  
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830  
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190094 no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µm pluriSelect 43-50060  
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407  
Polycarbonate centrifuge tubes Beckman Coulter 355651  
Protease Inhibitor Sigma-Aldrich S8830-20TAB  
PureCol Cell Systems 5005  
Q-Exactive mass spectrometer ThermoFisher    
rapifleX mass spectrometer Brucker    
Rat cortical neurons Cell Applications R882N-20 Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium Cell Applications R620K-100 Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophages Cell Applications R8818-10a  
Rat primary microglia Lonza RG535  
Sepharose CL-2B GE Healthcare 17014001  
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111  
Slide Dustsher 100204  
Sodium Chloride Scharlau SO0227  
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771  
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich S7920-100G  
Sodium hydroxide Scharlab SO0420005P  
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich S6422-100G  
SpeedVac Vacuum Concentrator ThermoFisher    
String software (functional protein association networks)     https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate ThermoFisher 34075  
Syringe 1.0 mL Terumo 8SS01H1  
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell Bio-Rad 1703940  
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508  
Tris Interchim UP031657  
Tris-Glycine Euromedex EU0550  
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287  
Ultracentrifuge Beckman Coulter A95765  
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti Beckman Coulter 342184  
Uranyl acetate Agar Scientific Ltd AGR1260A  
Whatman filter paper Sigma-Aldrich WHA10347510  
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich C2020-25G  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
  3. Sankowski, R., Mader, S., Valdes-Ferrer, S. I. Systemic Inflammation and the Brain: Novel Roles of Genetic, Molecular, and Environmental Cues as Drivers of Neurodegeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  4. Chakrabarty, S., Kabekkodu, S. P., Singh, R. P., Thangaraj, K., Singh, K. K., Satyamoorthy, K. Microglia in health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 43 (3), 25-29 (2015).
  5. Sankowski, R., Mader, S., Valdés-Ferrer, S. I. Systemic inflammation and the brain: novel roles of genetic, molecular, and environmental cues as drivers of neurodegeneration. Frontiers in cellular neuroscience. 9, 28 (2015).
  6. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  7. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  8. Domingues, P., et al. Tumor infiltrating immune cells in gliomas and meningiomas. Brain, Behavior, and Immunity. 53, 1-15 (2016).
  9. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nature Neuroscience. 19 (1), 20-27 (2016).
  10. Thion, M. S., et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell. 172 (3), 500-516 (2018).
  11. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  12. Rajendran, L., et al. Emerging Roles of Extracellular Vesicles in the Nervous System. The Journal of Neuroscience. 34 (46), 15482-15489 (2014).
  13. Gupta, A., Pulliam, L. Exosomes as mediators of neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 68 (2014).
  14. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  15. Budnik, V., Ruiz-cañada, C., Wendler, F. Extracellular vesicles round off communication in the nervous system. Nature Reviews Neurosciences. 17, 160-172 (2016).
  16. Raffo-Romero, A., et al. Medicinal Leech CNS as a Model for Exosome Studies in the Crosstalk between Microglia and Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4124 (2018).
  17. Zhou, Y., et al. Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (12), 4267-4274 (2017).
  18. Arab, T., et al. Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and OptiprepTM density gradient isolation. Journal of extracellular vesicles. 8 (1), 1603048 (2019).
  19. Murgoci, A. -N., et al. Brain-Cortex Microglia-Derived Exosomes: Nanoparticles for Glioma Therapy. ChemPhysChem. 19 (10), 1205-1214 (2018).
  20. Glebov, K., et al. Serotonin stimulates secretion of exosomes from microglia cells. Glia. 63 (4), 626-634 (2015).
  21. Hooper, C., et al. Wnt3a induces exosome secretion from primary cultured rat microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 144 (2012).
  22. Gabrielli, M., et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO reports. 16 (2), 213-220 (2015).
  23. Antonucci, F., et al. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity via enhanced sphingolipid metabolism. The EMBO Journal. 31 (5), 1231-1240 (2012).
  24. Frühbeis, C., Fröhlich, D., Kuo, W. P., Krämer-Albers, E. -M. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 182 (2013).
  25. Prada, I., et al. Glia-to-neuron transfer of miRNAs via extracellular vesicles: a new mechanism underlying inflammation-induced synaptic alterations. Acta neuropathologica. 135 (4), 529-550 (2018).
  26. Takenouchi, T., et al. Extracellular ATP induces unconventional release of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from microglial cells. Immunology Letters. 167 (2), 116-124 (2015).
  27. Yang, Y., Boza-Serrano, A., Dunning, C. J. R., Clausen, B. H., Lambertsen, K. L., Deierborg, T. Inflammation leads to distinct populations of extracellular vesicles from microglia. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 168 (2018).
  28. Duhamel, M., et al. Paclitaxel Treatment and Proprotein Convertase 1/3 (PC1/3) Knockdown in Macrophages is a Promising Antiglioma Strategy as Revealed by Proteomics and Cytotoxicity Studies. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1126-1143 (2018).
  29. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. Journal of Neuroscience Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  30. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
  31. Rashed, M. H., et al. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. Int. J. Mol. Sci. Int. J. Mol. Sci. 18 (18), (2017).
  32. Yuana, Y., Sturk, A., Nieuwland, R. Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Reviews. 27 (1), 31-39 (2013).
  33. Frohlich, D., et al. Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons: impact on neuronal firing rate, signal transduction and gene regulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  34. Krämer-Albers, E. -M., et al. Oligodendrocytes secrete exosomes containing major myelin and stress-protective proteins: Trophic support for axons. Proteomics. Clinical applications. 1 (11), 1446-1461 (2007).
  35. Verderio, C., et al. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Annals of Neurology. 72 (4), 610-624 (2012).
  36. Prada, I., Furlan, R., Matteoli, M., Verderio, C. Classical and Unconventional Pathways of Vesicular Release in Microglia. GLIA. 61, 1003-1017 (2013).
  37. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  38. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. , (2017).
  39. Kennedy, B. C., et al. Tumor-Associated Macrophages in Glioma: Friend or Foe. Journal of Oncology. 2013, 1-11 (2013).
  40. Potolicchio, I., Carven, G. J., Xu, X., Stipp, C., Riese, R. J., Stern, L. J., Santambroggio, L. Proteomic Analysis of Microglia-Derived Exosomes: Metabolic Role of the Aminopeptidase CD13 in Neuropeptide Catabolism1. The Journal of Immunology. 175, 2237-2243 (2005).
  41. Turola, E., Furlan, R., Bianco, F., Matteoli, M., Verderio, C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Frontiers in Physiology. 3, (2012).
  42. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes : shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends in Cell Biology. 25 (6), 364-372 (2015).
  43. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  44. de Vrij, J., et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells. International Journal of Cancer. 137 (7), 1630-1642 (2015).
  45. van der Vos, K. E., et al. Directly visualized glioblastoma-derived extracellular vesicles transfer RNA to microglia/macrophages in the brain. Neuro-Oncology. 18 (1), 58-69 (2016).

Tags

מדעי המוח סוגיה 160 פונקציות החיסון microglia מקרופאגים נוירונים תאים glioma מסחטות שלפוחיות
אפיון של תא החיסון-מסחטות נגזרות ושלפוחיות ולימוד השפעה פונקציונלית על סביבת התא
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lemaire, Q., Duhamel, M.,… More

Lemaire, Q., Duhamel, M., Raffo-Romero, A., Salzet, M., Lefebvre, C. Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment. J. Vis. Exp. (160), e60118, doi:10.3791/60118 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter