Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Karakterisering av immuncellede ekstracellulære vesikler og studere funksjonell innvirkning på cellemiljø

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/60118
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

Summary

Den nåværende rapporten fremhever kronologiske krav til ekstracellulær vesikkel (EV) isolasjon fra mikroglia eller blod makrofager. Mikroglia-avledede EV-er ble eVer evaluert som regulatorer av neurite utvekst mens blodmakrosme-avledede EV-er ble studert i kontroll av C6 glioma celle invasjon i in vitro analyser. Målet er å bedre forstå disse EV-funksjonene som immunmedier i spesifikke mikromiljøer.

Abstract

Den nevroinflammatoriske tilstanden i sentralnervesystemet (CNS) spiller en nøkkelrolle i fysiologiske og patologiske forhold. Microglia, de bosatte immuncellene i hjernen, og noen ganger de infiltrere benmargsavledede makrofagene (BMDMer), regulerer den inflammatoriske profilen til mikromiljøet i CNS. Det er nå akseptert at de ekstracellulære vesicle (EV) populasjoner fra immunceller fungerer som immun mediatorer. Dermed er deres samling og isolasjon viktig for å identifisere innholdet, men også vurdere deres biologiske effekter på mottakerceller. De nåværende dataene fremhever krologiske krav til EV-isolasjon fra mikrogliaceller eller makrofager i blodet, inkludert trinnene for ultracentrifugation og størrelseseklusjonskromatografi (SEC). En ikke-målrettet proteomisk analyse tillot validering av proteinsignaturer som EV-markører og karakteriserte det biologisk aktive EV-innholdet. Mikroglia-avledede EV-er ble også funksjonelt brukt på primær kultur av nevroner for å vurdere deres betydning som immunmeklere i neurite utveksten. Resultatene viste at mikroglia-avledede EV-er bidrar til å lette neurite utvekst in vitro. Parallelt ble blodmakrofag-avledede EV-er funksjonelt brukt som immunmeklere i sfæroide kulturer av C6 gliomaceller, resultatene som viser at disse EV-ene kontrollerer gliomacelleinvasjonen in vitro. Denne rapporten understreker muligheten for å evaluere EV-medierte immuncellefunksjoner, men forstår også de molekylære basene til en slik kommunikasjon. Denne dechiffreringen kan fremme bruk av naturlige vesikler og/eller in vitro-fremstilling av terapeutiske vesikler for å etterligne immunegenskaper i mikromiljøet av CNS-patologier.

Introduction

Mange nevropatologier er relatert til nevroinflammatorisk tilstand som er en kompleks mekanisme som i økende grad vurderes, men fortsatt dårlig forstått fordi immunprosessene er forskjellige og avhenger av cellemiljøet. Faktisk involverer CNS-lidelsene ikke systematisk de samme aktiveringssignalene og immuncellepopulasjonene, og dermed er de pro- eller antiinflammatoriske reaksjonene vanskelig å vurdere som årsaker eller konsekvenser av patologier. Hjernen bosatt makrofager kalt "microglia" synes å være i grensesnittet mellom nervesystemet og immunsystemet1. Microglia har en myeloid opprinnelse og er avledet fra eggeplommesekken under primitiv hematopoiesis for å kolonisere hjernen, mens perifere makrofager er avledet fra fosterleveren under definitiv hematopoiesis for å bli perifere makrofager2. Mikrogliacellene kommuniserer med nevroner og nevron-avledede glialceller som astrocytter og oligodendrocytes3. Flere nyere studier har vist at microglia er involvert i nevronal plastisitet under CNS utvikling og voksen vev homeostase, og også i inflammatorisk tilstand forbundet med nevrodegenerative sykdommer4,5. Ellers kan integriteten til blodhjernebarrieren bli kompromittert i andre CNS-patologier. Immunresponsen, spesielt i glioblastom multiforme kreft, støttes ikke bare av mikrogliaceller, da blodhjernebarrieren omorganiseres gjennom angiogene prosesser og tilstedeværelsen av lymfatiske kar6,7. Derfor oppstår en stor benmargsavledet makrofager (BMDMer) infiltrasjon i hjernesvulsten gjennom tumoravhengige angiogenesemekanismer8. Kreftcellene utøver en betydelig innflytelse på infiltrerte BMDMer som fører til immunsuppressive egenskaper og tumorvekst9. Dermed er kommunikasjonen mellom immuncellene og deres mikromiljø i hjernen vanskelig å forstå da celleopprinnelsen og aktiveringssignalene er forskjellige10,11. Det er derfor interessant å pågripe funksjonene til immuncellerelaterte molekylære signaturer i fysiologiske forhold. I denne forbindelse kan cellecellekommunikasjonen mellom immunceller og cellemikromiljø studeres gjennom frigjøring av ekstracellulære vesikler (EV-er).

EV-ene studeres mer og mer i reguleringen av immunfunksjoner i sunne samt patologiske tilstander12,13. To populasjoner, eksosomer og mikrovesikler, kan tas i betraktning. De presenterer forskjellige biogenese og størrelsesområder. Eksosomene er vesikler på ~ 30-150 nm diameter og genereres fra endosomale systemet og utskilles under fusjon av flervesikulære organer (MVB) med plasmamembranen. Mikrokjøretøyene er ca 100-1000 nm i diameter og genereres av en ytre spirende fra cellen plasmamembranen14. Fordi eksosom versus mikrovesicle diskriminering er fortsatt vanskelig å realisere i henhold til størrelse og molekylære mønstre, vil vi bare bruke begrepet EV i den nåværende rapporten. Ev-assosiert kommunikasjon i CNS representerer en forfedremekanisme siden studier viste deres engasjement i virvelløse arter, inkludert nematoder, insekter eller annelider15,16. Videre viser resultatene som viser at EV-er kan kommunisere med celler fra forskjellige arter, denne mekanismen for å være et nøkkellåssystem, basert først på overflatemolekylgjenkjenning mellom vesikler og mottakerceller og deretter tillate opptak av meklere16,17. Faktisk inneholder EV-ene mange molekyler som proteiner (f.eks. enzymer, signaltransduksjon, biogenesefaktor), lipider (f.eks. ceramid, kolesterol) eller nukleinsyrer (f.eks. DNA, mRNA eller miRNAer) som virker som direkte eller indirekte regulatorer av mottakercelleaktivitetene14. Det er derfor metodiske studier ble også utført på immunceller for å isolere EV-er og fullt karakterisere deres proteinsignaturer18,19.

De tidligste studiene viste frigjøring av eksosomer fra primærkald rottemikroglia som en udugelig mekanisme etter en Wnt3a- eller serotoninavhengig aktivering20,21. Funksjonelt i CNS regulerer mikroglia-avledede EV-er den synaptiske vesikkelfrigivelsen ved presynaptiske terminaler i nevroner som bidrar til kontroll av nevronal spenning22,,23. Microglia-avledede EV-er kan også forplante cytokiner-mediert inflammatorisk respons i store hjerneregioner24,,25. Viktigere, de ulike ligander for toll-lignende reseptor familie kan aktivere bestemte produksjoner av EV i microglia26. In vitro-studier viser for eksempel at LPS-aktiverte microglia BV2-cellelinjer produserer differensial EV-innhold, inkludert proinflammatoriske cytokiner27. Derfor kan det funksjonelle mangfoldet av underpopulasjoner av immunceller i CNS, microglia og infiltrere BMDMer, evalueres gjennom sine egne EV-populasjoner, inkludert EV-innvirkning på mottakerceller og identifisering av EV-innhold.

Vi har tidligere beskrevet metoder for å evaluere de funksjonelle egenskapene til microglia- og BMDM-avledede EV-er etter deres isolasjon16,19. I den foreliggende rapporten foreslår vi å uavhengig vurdere effekten av mikroglia-avledede EV-er på neurite utvekst, og effekten av makrofag-avledede EV-er på kontroll av gliomacelleaggregater. Denne studien foreslår også en bred proteomisk analyse av EV-fraksjonene for å validere EV-isolasjonsprosedyren samt identifisere de biologisk aktive proteinsignaturene. De gunstige effektene og molekylær dechiffrering av EV-innhold kan hjelpe deres mulige manipulasjon og bruk som terapeutiske midler i hjernesykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Primær kultur av Microglia / Makrofager

  1. Primær kultur av microglia
    1. Kultur kommersielle rotte primære microglia (2 x10 6 celler) (se Tabell over materialer) i Dulbecco modifisert Eagle medium (DMEM) supplert med 10% eksosomfri serum, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, og 9,0 g / L glukose ved 37 ° C og 5% CO2.
    2. Samle betinget medium etter en 48 h kultur og gå videre til isolering av EV.
  2. Primær kultur av makrofager
    1. Kultur kommersielle rotte primære makrofager (1 x10 6 celler) i mediet levert av produsenten (se Tabell over materialer)ved 37 °C og 5% CO2,med eksosomfri serum.
    2. Samle betinget medium etter en 24 h kultur og gå videre til isolering av EV.

2. Isolering av EV-er

  1. Pre-isolasjon av EV-er fra betinget medium
    1. Overfør det betingede kulturmediet fra mikroglia- eller makrofagkulturer (trinn 1.1.2 eller 1.2.2) til et konisk rør.
    2. Sentrifuge ved 1200 x g i 10 min ved romtemperatur (RT) for å pellet cellene.
    3. Overfør supernatanten til et nytt konisk rør. Sentrifuge på 1200 x g i 20 min ved RT for å eliminere apoptotiske organer.
    4. Overfør supernatanten til et 10,4 ml polykarbonatrør og overfør røret til en 70,1 Ti-rotor. Ultracentrifuge ved 100.000 x g i 90 min ved 4 °C til pellet ev.
    5. Kast den supernatant og resuspend pellet som inneholder EV-er i 200 μL av 0,20 μm filtrert fosfatbuffer saltvann (PBS).
  2. Isolering av EV-er
    1. Utarbeidelse av den hjemmelagde størrelsesekskluderingskromatografikolonnen (SEC)
      1. Tøm en glasskromatografikolonne (lengde: 26 cm; diameter: 0,6 cm) (se materialbordet),vask og steriliser den.
      2. Plasser et 60 μm filter nederst i kolonnen.
      3. Stable kolonnen med krysskoblet agarose gel filtrering base matrise for å skape en stasjonær fase av en 0,6 cm diameter og en 20 cm høyde.
      4. Skyll fasen med 50 ml 0,20 μm filtrert PBS. Oppbevars ved 4 °C ved bruk senere om nødvendig.
    2. Plasser den resuspended EV pellet på toppen av den stasjonære fasen av SEC-kolonnen.
    3. Samle 20 sekvensielle fraksjoner av 250 μL mens du fortsetter å legge til 0,20 μm filtrert PBS på toppen av stasjonær fase for å hindre tørking av kolonnen. Oppbevar brøkene ved -20 °C om nødvendig.
      MERK: En lengre lagring enn en uke kan utføres ved -80 °C for å opprettholde EV-integriteten for molekylær analyse.
  3. Matrix assistert laser desorpsjon ionisering (MALDI) massespektrometri analyse av SEC-fraksjoner
    1. Gå videre til EV-isolasjonen som beskrevet i avsnitt 2.2.
    2. Resuspend EV pellet med 200 μL av peptid kalibrering blanding løsning (se tabell over materialer).
    3. Fortsett til EV-innsamling som beskrevet i avsnittene 2.2.1 til 2.2.3.
    4. Tørk brøken helt med en vakuumkonsentrator.
    5. Rekonstituer fraksjonene med 10 μL 0,1 % trifluoroacetisk syre (TFA).
    6. Bland 1 μL rekonstituert fraksjon med 1 μL α-cyano-4-hydroksycinemisk syre (HCCA) matrise på en MALDI polert stål målplate.
    7. Analyser alle brøker med et MALDI-massespektrometer.
    8. Analyser generert spektra med dedikert programvare (se Materialtabell).

3. Karakterisering av EV-er

  1. Nanopartikkel sporing analyse (NTA)
    MERK:     NTA-analysen utføres med et nanopartikkelsporingsanalyseinstrument (se materialtabellen)og en automatisert sprøytepumpe.
    1. Lag en fortynning (område på 1:50 til 1:500) av hver SEC-brøk fra trinn 2.2.3 med 0,20 μm filtrert PBS.
    2. Vortex løsningen for å eliminere EV aggregater.
    3. Sett den fortynnede oppløsningen i en 1 ml sprøyte og plasser den i den automatiserte sprøytepumpen.
    4. Juster kamerainnstillingen til skjermvisningsnivå (3) og kameranivå (13).
    5. Klikk på Kjør og start følgende skript.
      1. Last prøven i analysekammeret (infusjonshastighet: 1000 i 15 s).
      2. Reduser og stabiliser hastighetsflyten for videoopptak (infusjonshastighet: 25 for 15 s). Ta tre påfølgende 60 s videoer av partikkelstrømmen.
      3. Juster kameranivået (13) og gjenkjenningsterskelen (3) før videoanalyse. Klikk på Innstillinger| Ok for å starte analysen og klikk på Eksporter når analysen er ferdig.
    6. Mellom hver brøkanalyse må du vaskes med 1 ml 0,20 μm filtrert PBS.
  2. Elektronmikroskopi (EM) analyse
    1. Isoler EV-er som beskrevet i avsnitt 2.
      MERK: Sterile forhold er ikke nødvendig.
    2. Gjenta avsnitt 3.1 for å kvantifisere EV-er.
      MERK: Bare positive fraksjoner vil bli brukt til EM-analyse.
    3. Bruk et 50 kDa sentrifugalfilter (se Tabell over materialer) til å konsentrere EV-inneholdende SEC-fraksjoner.
    4. Resuspend konsentrerte EV-er i 30 μL av 2 % paraformaldehyd (PFA).
    5. Last 10 μL av prøven på et karbonbelagt kobbergitter.
    6. Inkuber i 20 min i et vått miljø.
    7. Gjenta trinn 3.2.5 og 3.2.6 for en god absorpsjon av prøven på rutenettet.
    8. Overfør rutenettet til en dråpe på 1% glutaraldehyd i PBS i 5 min ved RT.
    9. Vask prøven med ultrapure vann flere ganger.
    10. Sammenlign prøven i 10 min på is med en blanding av 4% uranylacetat og 2% metylcellulose (1:9, v / v). Fjern overflødig av blandingen ved hjelp av et filterpapir.
    11. Tørk prøven og observer den under et transmisjonselektronmikroskop ved 200 kV (se materialtabellen).
  3. Vestlig blot analyse
    1. Protein utvinning
      1. Gjenta trinnene 3.2.1 til 3.2.3 for å isolere og konsentrere EV-er.
      2. Bland 50 μL RIPA-buffer (150 mM natriumklorid [NaCl], 50 mM Tris, 5 mM Etylenglykol-bis(2-aminoetylenther)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid [EGTA], 2 mMyl Etenediamine-tetraacetic acid [EDTA], 100 mM natriumfluorid [NaF], 10 mM natriumpyofosfat, 1% nonidet P-40, 1 mM Fenylmetanesulfonylfluorid [PMSF], 1x proteasehemmer) med EV-prøven (25 μL som følge av EV-konsentrasjonen på filteret) i 5 min på is for å trekke ut proteiner.
      3. Sonicate for 5 s (amplitude: 500 W; frekvens: 20 kHz), 3 ganger på is.
      4. Fjern vesikulært avfall ved sentrifugering ved 20.000 x g i 10 min, ved 4 °C.
      5. Samle supernatant og måle proteinkonsentrasjonen med Bradford protein analyse metode.
    2. Natrium dodecylsulfat polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) og vestlig blotting
      1. Bland proteinekstrakter (30 μg) med 5c Laemmli prøvebuffer (v/v).
      2. Last proteinblandingen på en 12% polyakrylamidgel.
      3. Migrere proteinene i gelen med TGS-buffer (25 mM Tris pH 8,5, 192 mM Glycine og 0,1% SDS), ved 70 V i 15 min og 120 V i 45 min.
      4. Overfør proteinene på nitrocellulosemembran med semitørre system ved 230 V i 30 min.
      5. Mem membranen i 1 time ved RT med blokkeringsbuffer (0,05 % Tween 20 m/v, 5 % melkepulver m/v i 0,1 M PBS, pH 7.4).
      6. Inkuber membranen over natten ved 4 °C med mus monoklonalt anti-humant varmesjokkprotein 90 (HSP90) antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer (1:100).
      7. Vask membranen tre ganger med PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 w / v) i 15 min.
      8. Inkuber membranen i 1 timer ved RT med geit pepperrotperoksidase-konjugert antimus IgG sekundært antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer (1:10,000).
        MERK: En negativ kontroll utføres ved hjelp av sekundært antistoff alene.
      9. Gjenta vasketrinnet (trinn 3.3.2.7).
      10. Avslør membranen med forbedret chemiluminescence (ECL) western blotting substratsett (se Tabell over materialer).
  4. Proteomisk analyse
    1. Proteinekstraksjon og in-gel fordøyelse
      1. Gjenta trinnene 3.2.1 til 3.2.3 for å isolere og konsentrere EV-ene. Gjenta trinn 3.3.1 for EV-proteinekstraksjon.
      2. Utfør proteinmigrasjon i stablingsgelen til en 12% polyakrylamidgel.
      3. Fest proteinene i gelen med coomassie blå i 20 min ved RT.
      4. Avgiftsdirektoratet hver farget gel stykke og kutte den i små biter av 1 mm3.
      5. Vask gelbitene suksessivt med 300 μL av hver løsning: ultrapure vann i 15 min, 100% acetonitrile (ACN) i 15 min, 100 mM ammonium bikarbonat (NH4HCO3) i 15 min, ACN:100 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) i 15 min og 100% ACN i 5 min med kontinuerlig omrøring.
      6. Tørk helt gelstykker med vakuumkonsentrator.
      7. Utfør proteinreduksjon med 100 μL på 100 mM NH4HCO3 som inneholder 10 mM dithiothreitol i 1 time ved 56 °C.
      8. Utfør proteinalkylering med 100 μL på 100 mM NH4HCO3 som inneholder 50 mM iodoacetamid i 45 min i mørket ved RT.
      9. Vask gelbitene etter hvert med 300 μL av hver oppløsning: 100 mM NH4HCO3 i 15 min, ACN:20 mM NH4HCO3 (1:1, v/v) i 15 min og 100 % ACN i 5 min med kontinuerlig omrøring.
      10. Tørk gelbitene helt med en vakuumkonsentrator.
      11. Utfør proteinfordøyelse med 50 μL trypsin (12,5 μg/ml) i 20 mM NH4HCO3 over natten ved 37 °C.
      12. Trekk ut de fordøyde proteinene fra gelen med 50 μL 100% ACN i 30 min ved 37 °C og deretter 15 minutter ved RT med kontinuerlig omrøring.
      13. Gjenta følgende ekstraksjonsprosedyrer to ganger: 50 μL 5 % TFA i 20 mM NH4HCO3-oppløsning i 20 min med kontinuerlig omrøring.
      14. Tilsett 100 μL på 100% ACN i 10 min med kontinuerlig omrøring.
      15. Tørr fordøyd proteiner med vakuumkonsentrator og resuspend i 20 μL av 0,1% TFA.
      16. Desalt prøven ved hjelp av en 10 μL pipettespiss med C18 reversfasemedier for avsalting og konsentrasjon av peptider (se materialbordet)og elute peptider med ACN:0.1% maursyre (FA) (80:20, v/v).
      17. Tørk prøven helt med en vakuumkonsentrator og resuspend i 20 μL ACN:0.1% FA (2:98, v / v) for flytende kromatografi tandem massespektrometri (LC-MS / MS).
    2. LC-MS/MS-analyse
      1. Last inn det fordøyde peptidet i LC-MS/MS-instrumentet og utfør eksempel- og dataanalyse i henhold til parametere som er beskrevet i detalj andre steder42.
    3. Analyse av rådata
      1. Behandle massespektrometridata for å identifisere proteiner og sammenligne identifiserte proteiner i hver prøve med en kvantitativ proteomics programvarepakke ved hjelp av standardparametere.
      2. Eksporter, ved hjelp av standardparametere, listen over eksklusive og overrepresenterte proteiner fra EV positive prøver i en programvare som forutsier proteinnettverk og biologiske prosesser.
      3. Sammenlign listen over identifiserte proteiner i brøkene med de 100 ev-markørene fra Exocarta open access-databasen (se materialtabellen).

4. Analyse av funksjonelle eVs effekter

  1. Neurite utvekst analyse på PC-12 cellelinje
    1. Kultur PC12 cellelinje i komplett DMEM medium (2 mM L-glutamin, 10% fosterhest serum (FHS), 5% foster storfe serum (FBS), 100 UI/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin).
      MERK: Sera er exosome gratis i hele prosedyren.
    2. Legg til et dekkglass (alle brønner) til en 24-brønns plate; belegge platen med poly-D-lysin (0,1 mg/ml) og frø 260 000 celler/brønn.
    3. Inkuber cellene ved 37 °C under 5 % CO2.
    4. Etter 24 t inkubasjon, endre medium til DMEM differensiering medium (DMEM med 2 mM L-glutamin, 0,1% FHS, 100 UI/ ml penicillin, 100 μg/ ml streptomycin) med 1 x 106 microglia EVs (fra trinn 1.1.2).
      MERK: Kontrolltilstand utføres uten microglia EV-er i differensieringsmediet.
    5. På dag 4 etter såing laster du alle brønnene med 100 μL komplett DMEM-medium.
    6. På dag 7 etter seeding, fikse cellene med 4% PFA i 20 min ved RT og skyll tre ganger (10 min hver) med PBS.
    7. Flekk cellene med rhodamine-konjugert phalloidin i 30 min ved 4 °C og skyll 3 ganger (10 min hver) med PBS.
    8. Flekk cellene med fortynnet Hoechst 33342 (1:10,000) i 30 min ved RT og skyll 3 ganger (10 min hver) med PBS.
    9. Monter dekkglasset på et lysbilde med fluorescerende monteringsmedium (se Tabell over materialer).
    10. Analyser lysbildet med et konfusisk mikroskop, ta 5 tilfeldige bilder av hvert lysbilde.
    11. Mål neurite utvekst ved hjelp av en automatisert kvantifisering programvare (total neurite lengde) som beskrevet i detalj andre steder43.
  2. Neurite utvekst på rotte primære nevroner
    1. Coat en 8-brønns glasssklie med poly-D-lysin (0,1 mg/ml) og laminin (20 μg/ml).
    2. Kultur rotte kommersielle primære nevroner i passende kultur medium (se Tabell over materialer) ved plating 50.000 celler per brønn og inkubere cellene ved 37 °C under 5% CO2 for 48 h.
      MERK: Sera er exosome-free i hele prosedyren.
    3. Tilsett 1 x10 6 microglia EV-er til nevronkulturmedium og inkuber ved 37 °C under 5 % CO2 i 48 timer mer.
      MERK: Kontrolltilstand utføres uten microglia EV i neuron kultur medium.
    4. Følg trinn 4.1.6 til 4.1.9 for å fikse og flekker cellene.
    5. Følg trinn 4.1.10 og 4.1.11 for å analysere lysbildet.
  3. Glioma celle invasjon
    1. Resuspend C6 rotte gliomaceller i komplett DMEM medium (DMEM med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1x antibiotika) som inneholder 5% kollagen ved en endelig konsentrasjon på 8000 celler i 20 μL.
      MERK: Sera er exosome-free i hele prosedyren.
    2. Plasser 5 ml PBS PÅ bunnen av en 60 mm vevkulturrett. Inverter lokket og deponeringsdråper på 20 μL (8000 celler) cellesuspensjon på bunnen av lokket.
    3. Snu lokket på det PBS-fylte bunnkammeret og inkuber platen ved 37 °C og 5 % CO2 i 72 timer til cellesfæroider dannes.
    4. Tilsett 1 x10 8 makrofag EV-er (fra trinn 1.2.2) til en 2,2 mg/ml kollagenblanding (2 ml storfekollagen type I-oppløsning [3 mg/ml] med 250 μL 10x minimum essensielt medium (MEM) og 500 μL 0,1 M natriumhydroksid).
      MERK: Kontrolltilstand utføres uten makrofag-EV-er i kollagenblandingen.
    5. Fordel kollagenblandingen som inneholder EV-er i en 24-brønns plate for innebygging av cellesfæroider.
    6. Implanter de nydannede cellesfæroidene i midten av hver brønn.
    7. Inkuber platen i 30 min ved 37 °C og 5 % CO2 for å stivne gelen.
    8. Deretter overlegg 400 μL komplett DMEM medium på kollagen matrise i hver brønn.
    9. Inkuber det komplette systemet i totalt 6 dager ved 37 °C og 5 % CO2.
      MERK: Celleinvasjon ut av sfæroiden overvåkes av digital fotografering ved hjelp av et omvendt lysmikroskop ved hjelp av et 4x/0.10 N.A.-mål.
    10. Få bilder av hver brønn hver dag.
    11. Behandle bilder og kvantifisere invasjon av celle sfæroide områder ved hjelp av programvaren som tidligere beskrevet i detalj42.
      MERK: Invasjon og sfæroide områder ble normalisert for hver dag til invasjonen og sfæroide områder målt på dag 0.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En av de viktigste utfordringene med å tilskrive biologiske effekter til ekstracellulære vesikler (EV)-er er evnen til å isolere EV-ene fra hele kulturmediet. I denne rapporten presenterer vi en metode ved hjelp av ultracentrifugation (UC) og størrelse-eksklusjon kromatografi (SEC) som er koblet til storskala analyse av protein signaturer for å validere EV markører og identifisere bioaktive forbindelser. Makrofag- eller mikroglia-avledede EV-er ble isolert fra det betingede mediet etter henholdsvis 24 timer eller 48 timer (figur 1).

Figure 1
Figur 1: Ekstracellulær Vesicle (EV) samling og isolasjon strategier. De apoptotiske legemene og celleavfallet ble skilt fra mikroglia- eller makrofag-betinget medium ved påfølgende sentrifugasjonstrinn. Fra supernatanten ble EV-er isolert av ultracentrifugation (UC). UC pellet som inneholder EV-er ble lastet på kolonne og atskilt av størrelsesekskludering kromatografi (SEC) i 20 forskjellige eluted fraksjoner. Som avslørt i de videre trinnene (elektronmikroskopi, nanopartikkelsporingsanalyse og proteomisk analyse), ble SEC-fraksjonene samlet og organisert i 1F-EV-, 2F-EV+ og 3F-EV-. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Metoden fulgte påfølgende sentrifugeringstrinn: den første til å fjerne cellene og den andre for å fjerne cellulære rusk og apoptotiske kropper. Deretter ble supernatanten overført til et nytt rør for å utføre en ultracentrifugation på 100.000 x g i 90 min. Vesikler ble samlet sammen med proteinaggregater i den endelige UC pellet. En SEC-kolonne ble brukt til å skille forbindelsene i henhold til deres størrelse og fjerne aggregatene (figur 1). For å bekrefte isoleringen av EV-er fulgte hver SEC-fraksjon en nanopartikkelsporingsanalyse (figur 2A).

Figure 2
Figur 2: Analyse av SEC-fraksjonene. (A) Nanopartikkel sporingsanalyse (NTA) av SEC-fraksjoner. Det totale antall partikler i hver SEC-fraksjon presenteres med stolpediagrammer. De oransje stolpediagrammene viser de tre påfølgende EV+-brøkene (F5–F7). -BJeg har ikke noe valg. Skjermbilder av NTA-kammeret viser betydelige forskjeller i partikkelstrømmen mellom SEC-fraksjoner. (D) Komplementær MALDI massespektrometrianalyse. Fra en annen UC pellet som inneholder EV-er, ble et standard kontrollpeptidsett lagt til før SEC-separasjon for å validere ytelsen til SEC-strategien. Hver SEC-fraksjon ble analysert med matrixassistert laserdesorpsjonsionisering - flytid (MALDI-TOF) for å bestemme standardpositive fraksjoner. I de ni første spektra (brøk 1 til 9) ble det ikke observert noe signal. Påvisning av disse frie standardene var mulig i de følgende brøkene (brøker 10 til 20) som bekrefter sec-prosedyrens evne til å skille EV-er (F5–F7) fra oppløselige komponenter (F10–F20). (E) Vestlig blot analyse av SEC fraksjoner som en EV markør foreløpig analyse. EV+-fraksjonene (F5–F7) ble samlet som ett utvalg (2F-VE+), mens EV-fraksjonene (henholdsvis F1–F4 og F8–F20) ble samlet i to andre prøver kalt 1F-EV- og 3F-EV-. Resultatene viste tilstedeværelsen av et heat-shock Protein 90 (HSP90) (EV positiv markør) signal i 2F-EV+, og også i cellelysat som positiv kontroll, sammenlignet med de andre fraksjonene (1F-EV- og 3F-EV-). -FJeg har ikke noe valg. Elektronmikroskopianalyse av EV-positiv prøve (2F-EV+). Observasjonen under to påfølgende forstørrelser viste tilstedeværelsen av EV-er i et størrelsesområde rundt 100 nm (hvite piler) og rundt 400 nm (pilhode). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Partikkeltallet var betydelig høyere i brøkene 5, 6 og 7 enn i forrige (F1–F4) og følgende (F8–F20). Det var mulig å se en partikkelstrøm i disse fraksjonene selv om noen få partikkeler ble observert i følgende fraksjoner (figur 2B,C). Denne separasjonen forhindrer ikke muligheten for at andre fraksjoner enn F5–F7 kan inneholde en liten mengde vesikler, eller til og med at EV-rike fraksjoner F5 til F7 kan inneholde molekylære kontaminanter. For i det minste å sikre at F5-F7-fraksjonene er fri for forurensende ko-eluting molekyler, var det nødvendig å følge tidskursutvandringen av de forskjellige forbindelsene i SEC-prosedyren. For å gjøre dette, kontroll peptid standarder ble lagt til en lignende UC pellet som tidligere brukt. Dette preparatet ble igjen skilt ved hjelp av SEC-prosedyren. Deretter ble en matrise assistert laser desorption ionisering - tid for flytur (MALDI) massespektrometri analyse utført for å identifisere SEC-fraksjonene der standarder ble eluted (Figur 2D). På grunn av masseområdet ble bare ioniserte produkter fra peptidstandarder fulgt i denne analysen. Resultatene viste at disse produktene var påvisbare i brøkene 10 til 20, noe som viste at ethvert løselig protein ikke kan eluteres i de samme fraksjonene som EV-ene (F5–F7). Disse resultatene bekreftet interessen for denne tilnærmingen i separasjon av EV-er fra ikke-EV-komponenter. Selv om vi antar at F8–F20-brøkene kunne inneholde en gjenværende brøkdel av EV-er, bestemte vi oss i følgende eksperimenter for å kombinere EV-positive brøker (F5–F7) i et enkelt utvalg kalt 2F-EV+. Vi kombinerte også de andre SEC-fraksjonene i to prøver kalt 1F-EV- (F1–F4) og 3F-EV- (F8–F20). Vi grupperte i tre prøver av flere grunner. For det første ville antall SEC-fraksjoner øke tiden for molekylære analyser, men også funksjonelle in vitro-studier. EV-positive SEC-fraksjoner viser separat lavere partikkeltall og kompromitterer også påvisning av molekylære forbindelser. På samme måte ble det ansett som mer fornuftig å gruppere fraksjonene F8-F20 for å konsentrere seg, om nødvendig, de gjenværende vesikler og sjekke deres tilstedeværelse av en foreløpig vestlig blot analyse mot HSP90, en EV markør. Interessant, et positivt signal for HSP90 ble oppdaget i brøken 2F-EV +, også i cellen lysate som positiv kontroll, men ikke i 1F-EV- og 3F-EV- prøver (Figur 2E og Supplerende Figur S1 som kontroll). Denne analysen bekrefter kun interessen for 2F-EV+ og riktig styring av de tidligere SEC-fraksjonene. For å bekrefte EV-isolasjon analyserte et ekstra eksperiment ved hjelp av elektronmikroskopi bare 2F-EV+-prøven og tillot observasjon av EV-er med en typisk morfologi og størrelsesmetroogenitet mellom 100 og 400 nm (Figur 2F,G).

Et annet viktig trinn i valideringen var proteomisk analyse (figur 3). Vi utviklet en hel massespektrometrianalyse med flere mål: (i) bekrefte isoleringen av EV-er med påvisning av et høyt antall EV-markører i 2F-EV+, (ii) identifiserer til slutt kontaminantproteiner i EV negative prøver (1F-EV- og 3F-EV-) og (iii) karakteriserer proteininnholdet i EV-er som støtter deres biologiske aktiviteter.

Figure 3
Figur 3: Proteomisk analyse av EV-positive og EV-negative prøver. (A)Etter tre uavhengige EV-isolasjoner fra lignende mikrogliacellepreparater ble prøvene 1F-EV-, 2F-EV+ og 3F-EV- lastet for natrium dodecylsulfatpolyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) og migrerte til stablingsgelen for å konsentrere proteiner for å realisere deres in-gel fordøyelse. De resulterende peptidene ble deretter analysert av flytende kromatografi tandem massespektrometri (LC-MS/ MS) for å identifisere de tilsvarende proteinene. (B) Sammenligning av identifiserte proteiner mellom prøvene 1F-EV- og 2F-EV+ som viser vanlige proteiner i begge brøkene (19) og proteiner som utelukkende oppdages i 2F-EV+-fraksjonen (522). Varmekartet viser den relative representasjonen der alle vanlige proteiner mellom 1F-EV- og 2F-EV+ triplicates var overrepresentert (rød) i 2F-EV+ prøvene. (C) Sammenligning av identifiserte proteiner mellom brøkene 2F-EV+ og 3F-EV- som viser vanlige proteiner mellom triplikater (113) og utelukkende representerte proteiner (428 i 2F-EV+ og 11 i 3F-EV-). Varmekartet viser den relative representasjonen i to klynger. En (klynge A) presenterer 5 overrepresenterte proteiner i 3F-EV-prøven og en andre (klynge B) presenterer 108 overrepresenterte proteiner i 2F-EV+. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fra cellekondisjonerte medier førte UC- og SEC-prosedyren til tre prøver 1F-EV-, 2F-EV+ og 3F-EV-. De tilsvarende proteinene ble ekstrahert og konsentrert av natrium dodecylsulfat polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE). Etter en kort migrering i stabling gel, prøvene ble samlet inn av et band excision, overført i forskjellige rør for å være i gel fordøyd. Produktene ble separert av online reversert fase kromatografi direkte koblet til en massespektrometer for analyse (Figur 3A).

Følgende resultater, som et eksempel på hele prosedyren, ble hentet fra mikroglia-betinget medium etter en 48 h kultur. Rådataene ble sendt til en rotteproteindatabase. De identifiserte proteinene ble sammenlignet mellom prøvene 1F-EV- og 2F-EV+(Figur 3B)og mellom prøvene 2F-EV+ og 3F-EV- (Figur 3C). I den første sammenligningen viste Venn-diagrammet 19 vanlige proteiner i både fraksjoner og 522 proteiner som utelukkende ble oppdaget i 2F-EV+-fraksjonen. Analysen ved hjelp av en kvantitativ proteomics programvare tillot identifisering av den relative representasjonen av de vanlige proteinene. Resultatene viste et varmekart der alle vanlige proteiner mellom 1F-EV- og 2F-EV+ triplikater var overrepresentert (rød) i 2F-EV+ prøvene. I den andre sammenligningen mellom brøkene 2F-EV+ og 3F-EV-, ble 113 vanlige proteiner identifisert mellom triplikater. Videre ble 428 proteiner utelukkende oppdaget i 2F-EV + og 11 proteiner ble utelukkende funnet i 3F-EV-. Etter den kvantitative analysen fremhevet varmekartrepresentasjonen av de 113 vanlige proteinene to klynger der klyngen A presenterte fem overrepresenterte proteiner i 3F-EV-prøven og klyngen B presenterte 108 overrepresenterte proteiner i 2F-EV+.

De 428 proteinene som utelukkende representerte, og de 108 proteinene som er overrepresentert i 2F-EV+ ble sendt til Exocarta open access-databasen for å oppdage EV-assosierte molekyler. Analysen av de 100 ev markører i Exocarta fremhevet tilstedeværelsen av 86 EV-assosierte proteiner i 2F-EV + (Figur 4A).

Figure 4
Figur 4: Analyse av proteiner fra 2F-EV+-prøven. (A) Et basseng på 536 proteiner (428 eksklusive og 108 overrepresenterte proteiner) ble sendt til Exocarta-databasen for å oppdage EV-assosierte molekyler. Molekylsymboler for de 86 EV-tilknyttede proteinene som ble påvist i de 100 ev-markørene fra Exocarta-databasen. (B) Prediksjonen av proteininteraksjoner og deres tilknytning til utvalgte biologiske prosesser viste immun- og nevrobeskyttende veier i 2F-EV+-prøven. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Interessant, analysen av de 5 vanlige proteinene i klyngen A og de 11 proteinene utelukkende representert i 3F-EV- var ikke knyttet til noen EV-markør (data ikke vist). Til slutt viste prediksjonen av proteininteraksjoner og deres tilknytning til utvalgte biologiske prosesser tilstedeværelsen i 2F-EV+ brøkdelen av immunmeklere (21%) noen ganger involvert i kontroll av den inflammatoriske responsen (4,1%) (Figur 4B). EV-innholdet i 2F-EV+ var også forbundet med nevronal utvikling (16,8 %), nevrondifferensiering (5 %) kontroll av nevronal død (3,8 %) som er i samsvar med følgende neurite utvekstanalyse.

Strategien vi valgte gjør dermed det mulig å få tilgang til alle data og gir en prediksjon av EV-medierte funksjoner før de biologiske analysene som vi deretter utførte (figur 5).

Figure 5
Figur 5: EV-avhengige f unctional analyser. Effektene av mikroglia-avledede EV-er ble evaluert på neurite utvekst (øvre ramme) og effekten av makrofag-avledede EV-er ble e-er e-er e-er e-er e-er eVs ble evaluert på glioma celle invasjon (nedre ramme). (A, B) Neurite lengden ble målt på PC-12 celler (Panel A ble modifisert fra Raffo-Romero et al.16 med tillatelse) eller rotte primære nevroner (B). Resultatene viste en betydelig økning i utveksten under EV-er (+ EV-er) sammenlignet med kontroll (Ctrl). Skala bar = 20 μm. (C, D) Tidsforløp av C6 glioma spheroid invasjon i kollagen i nærvær av rotte primære makrofag-avledet EV (C6 + EV) eller kjøretøy (C6 kontroll). C6 spheroid 3D invasjonen i kollagen ble overvåket og kvantifisert opptil 6 dager. Kvantifisering av tumorcelleinvasjon er vist ved 1, 2, 3 eller 6 dager (C) som observert på representative bilder (D). Skala bar = 500 μm. For neurite utvekstanalyser ble betydningen beregnet av unpaired Student t-test (* p < 0,05, ** p < 0,01 og *** p < 0,001). For invasjonsanalyse ble betydningen beregnet av enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys post hoc-test. Feilfeltene angir relativ standardfeil for tre uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

På denne måten ble de nevrotrofiske funksjonene til mikroglia-avledede EV-er studert på PC-12 cellelinje og rotte primære nevroner. Resultatene viste en positiv effekt på neurite utvekst (figur 5A, B). Tilstedeværelsen av EV-er økte henholdsvis ca. 6 og 1,5 ganger neuritenettverket i lengde og/eller i antall i PC-12 og primære nevroner sammenlignet med en kontrolltilstand. I en annen sammenheng studerte vi også effekten av makrofag-avledede EV-er på en hjernesvulstinvasjon (figur 5C,D). Det ble vurdert ved hjelp av 3D tumor sfæroider innebygd i en matrise av kollagen. Sfæroider generert med C6 rotte glioma celler ble dyrket i 6 dager i en kollagen matrise som inneholder (eller ikke inneholder) EV renset fra rotte makrofager kultur medium. Kollagenmatrisen gir en struktur der tumorceller kan invadere og spre seg ut av sfæroiden. De makrofag-avledede EV-ene svekket veksten og invasjonen av glioma sfæroider. Etter en 6 dagers kultur ble det observert en 50 % reduksjon av invasjonen i EV-behandlede sfæroider sammenlignet med kontrollen. Dette resultatet viste at makrofager kan produsere EV-er med anti-tumorale og/eller antiinvasive faktorer som påvirker gliomaveksten.

Supplementary Figure S1
Supplerende figur S1: Bilder av membran som brukes til vestlig-blotting eksperiment. (A) Originalbilde av den vestlige flekken fra figur 2E (mot HSP90 EV-markør). (B) Ponceau farging bilde av samme membran som viser riktig lasting av protein ekstrakter fra 1F-EV-, 2F-EV + og 3F-EV- prøver. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sentralnervesystemet (CNS) er et komplekst vev der celle-til-celle-kommunikasjon regulerer normale nevronale funksjoner som er nødvendige for homeostase30. EV-er er nå mye studert og beskrevet som viktig molekylær last for celle-til-celle kommunikasjon31. De leverer spesielt en cocktail av meklere til mottakerceller og påvirker dermed deres funksjoner i sunne og patologiske forhold32. Nyere studier indikerer at EV-er spiller en avgjørende rolle i CNS24,33,34 og spesielt de fra hjernens immunceller35,36. Balansen mellom pro- og antiinflammatoriske immunresponser er avgjørende og gjør det mulig å opprettholde hjernens integritet under synaptisk utvikling og nevronale aktiviteter gjennom hele livet. To forskjellige situasjoner med immunresponser ble diskutert i denne studien: forholdet (i) mellom mikroglia og nevroner og (ii) mellom infiltrere makrofager og gliomceller. For det første er mikroglia de bosatte makrofagene i hjernevevet hvor de spiller en viktig immunrolle i håndteringen av mikromiljøets endringer for å sikre nevronale aktiviteter. Men overdreven pro-inflammatoriske mekanismer kan støttes av overaktivert microglia og føre til nevrodegenerative lidelser37,38. I motsetning krever høyverdige gliomer antiinflammatoriske profiler og involverer tumorrelaterte makrofager (TAMs) rekruttert i tumorstedet. Benmargsavledede makrofager (BMDMer) representerer en stor populasjon av disse TAM-ene i nær forhold til gliomceller. Under påvirkning av svulsten viser BMDMs in vivo antiinflammatoriske og pro-tumorale profiler39. Hvordan disse BMDMs kunne kontrollere in vitro tumoral celle invasjon er et avgjørende spørsmål i denne rapporten. Det er derfor, makrofag-avledet EV ble brukt alene i glioma sfæroid invasjon analyse. Sammen i co-kultur ville gliomacellene ha påvirket makrofagene til å produsere andre EV-populasjoner med antiinflammatoriske profiler. Direkte bruk av immun EV kan være mye bedre som anti-tumoral agent. Derfor opprettholder immunceller celle-til-celle-kommunikasjon i spesifikke mikromiljøer der den inflammatoriske balansen er sterkt påvirket av eksterne signaler40,41. Forståelsen av EV-medierte immunresponser representerer en stor utfordring for å begrense patogenesen av mange lidelser. Identifisering av biologisk aktivt EV-innhold er en nøkkel til å forstå dysregulerte inflammatoriske prosesser og foreslå nye terapeutiske strategier42,43.

I denne studien presenterer vi en metodikk som består i en differensial ultracentrifugation prosess som det første trinnet for å eliminere celle rusk, apoptotiske organer og løselige molekyler, kombinert med størrelse utelukkelse kromatografi for å isolere EV-er fra molekylære aggregater. Når EV-populasjonene evalueres i biologiske analyser, er det avgjørende å diskriminere EV-innholdet fra andre samisolerte materialer. Derfor forbedret vi isolasjonen for å skille EV- fra ikke-EV-tilknyttede forbindelser. Ved å legge til standard proteiner i kontrollprøver sendt til SEC-prosedyren, var vi da i stand til å lokalisere sine elutionfraksjoner av MALDI-TOF. Fordi standardene er frie molekyler, er de globalt co-elute med prøve-assosiert molekylære aggregater knyttet til ikke EV-materialer. Dermed ble EV-fraksjonene fra eksperimentelle prøver validert i en pålitelig isolasjonsprosedyre. I tillegg utviklet vi en dobbel proteomisk analysestrategi. Med unntak av bruken av anti-HSP90-antistoffet ved vestlig oppblåsthet som en EV-markør foreløpig deteksjon, bestemte vi oss for å validere riktig EV-fraksjon ved en ikke-målrettet påvisning av EV-tilknyttede proteinsignaturer. Faktisk var den nåværende tilnærmingen ikke bevisst fokusert på påvisning av flere kjente EV-markører på grunn av utilstrekkelig spesifisitet og følsomhet for visse antistoffer. Variasjonen og overfloden av noen EV-markører på overflaten av EV-underpopulasjoner er fortsatt kontroversielle i isolasjonsprosedyrene. Videre kan en antistoffbasert metodikk representere en grense i et høyt antall organismer på grunn av mangel på kommersielle antistoffer, mens EV-studiene nå er et hett tema i biologi. Denne ikke-målrettede analysen tillot identifisering av et høyere antall molekyler som allerede er beskrevet som EV-markører (86 proteiner i de 100 ev-markørene fra Exocarta-databasen). Til slutt kan denne tilnærmingen være veldig nyttig for å validere EV-isolasjonen fra dårlig beskrevne organismer, forutsatt at de oppdagede proteinene kunne presentere betydelige homologier til kjente EV-markører. Som nylig beskrevet, kan en storskala proteomisk analyse være et alternativ til å bruke bare noen få vilkårlige markører43. Dette vil forbedre diskrimineringen av EV+-fraksjoner og identifisering av aktivt innhold før bruk i biologiske analyser.

Faktisk er det nødvendig å knytte karakteriseringen av EV-innholdet til effektene som ble observert i biologiske analyser. Faktisk antyder den biologiske virkningen av EV-er til mottakerceller vesikulære meklere eller effektorer å være involvert. Igjen tillater den samme ikke-målrettede analysen identifisering av biologisk aktive molekyler. En mulig optimalisering i denne analysen gjelder hvilke typer molekyler det er mulig å identifisere. Vår strategi var basert på den store analysen av proteinsignaturer og førte til prediktive biologiske veier knyttet til immunrespons og nevronoverlevelse. Det er viktig å vurdere de andre molekylfamiliene, inkludert lipider, mRNA og microRNAs for eksempel. Våre nåværende studier knytter disse ekstra identifikasjonene til proteinsignaturene for å få global kunnskap om denne EV-avhengige kommunikasjonen.

Mange terapeutiske tilnærminger er planlagt i de kommende årene. Gitt at EV-ene lett kan krysse blodhjernebarrieren og nå det patologiske vevet, kan disse molekylære lastene brukes på forskjellige måter. Selv om denne studien ikke fremhevet EV overflatemolekyler, er deres identifikasjon fortsatt nødvendig for å bedre forstå adresseringsprosessen mot målceller og vev. Den proteomiske analysen i vår metodikk gir tilgang til disse dataene. Ellers presenterte vi i denne rapporten in vitro-produksjonen av EV-er som gunstige cocktailer. Vi optimaliserte ikke de beste forholdene for å prime eller aktivere immuncellene på forhånd. Dette punktet er avgjørende fordi mikromiljøet i vevet har en direkte innvirkning på immuncellene og bidrar til slutt til å forme biogenesis av sine EV-er. I tilfelle av glioblastom for eksempel, har det blitt funnet at kreftcellene produserer sine egne EV-er, og dermed bidrar til å orientere de nærliggende TAMs mot antiinflammatoriske profiler og deres lokale immunsuppresjon44,45. Dette er grunnen til at makrofag-avledede EV-er i gliomamiljøet er forskjellige fra de som produseres i en enkelt makrofagkultur. Dermed brukte vi direkte makrofag-avledede EV-er, separat produsert fra en enkelt makrofagkultur, for å kontrollere gliomsfæren fordi en makrofag-glioma co-kultur ikke har kontroll over tumorveksten. Ytterligere terapeutiske strategier kan forhindre denne in vivo immunosuppression ved hjelp av pro-inflammatorisk og anti-tumoral EV produsert in vitro fra aktiverte makrofager. En lignende strategi kan brukes i sammenheng med nevrodegenerative sykdommer gjennom bruk av EV-er avledet fra microglia riktig varslet for å produsere en nevrobeskyttende og antiinflammatorisk respons som favoriserer nevronal overlevelse. Til slutt er studiene av EV-mediert kommunikasjon mellom immunceller og in vivo mikromiljø nøkkelen til å tillate en bedre forståelse av patogenese og designe innovative terapeutiske tilnærminger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Det presenterte arbeidet ble støttet av Ministère de L'Education Nationale, de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche og INSERM. Vi anerkjenner takknemlig BICeL- Campus Scientific City Facility for tilgang til instrumenter og tekniske råd. Vi anerkjenner takknemlig Jean-Pascal Gimeno, Soulaimane Aboulouard og Isabelle Fournier for massespektrometrihjelpen. Vi anerkjenner takknemlig Tanina Arab, Christelle van Camp, Francoise le Marrec-Croq, Jacopo Vizioli og Pierre-Eric Sautière for deres sterke bidrag til den vitenskapelige og tekniske utviklingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-rad 4561045EDU  
Acetonitrile Fisher Chemicals A955-1  
Amicon 50 kDa centrifugal filter Merck UFC505024  
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 9830  
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) Santa-cruz sc-13119  
B27 Plus supplement Gibco A3582801  
BenchMixer V2 Vortex Mixer Benchmark Scientific BV1003  
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) Bio-Rad 5000006  
C18 ZipTips Merck Millipore ZTC18S096  
C6 rat glioma cell ATCC ATCC CCL-107  
Canonical tubes Sarstedt 62.554.002  
Centrifuge Eppendorf 5804000010  
CO2 Incubator ThermoFisher    
Confocal microscope LSM880 Carl Zeiss LSM880  
Cover glass Marienfeld 111580  
Culture Dish (60 mm) Sarstedt 82.1473  
Dithiothreitol Sigma-Aldrich 43819  
DMEM Gibco 41966029  
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph ThermoFisher    
Electron microscope JEM-2100 JEOL    
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich 03777-10G  
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich ED-100G  
Exo-FBS Ozyme EXO-FBS-50A-1 Exosome depleted FBS
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs)     http://www.exocarta.org/
Fetal Bovine Serum Gibco 16140071  
Fetal Horse Serum Biowest S0960-500  
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001  
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe Fisherbrand 12893543  
FlexAnalysis Brucker    
Fluorescence mounting medium Agilent S3023  
Formic Acid Sigma-Aldrich 695076  
Formvar-carbon coated copper grids Agar scientific Ltd AGS162-3  
Glucose Sigma-Aldrich G8769  
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich 340855  
Hoechst 33342 Euromedex 17535-AAT  
Idoacetamide Sigma-Aldrich I1149  
InstantBlue Coomassie Protein Stain Expedeon ISB1L  
Invert light microscope CKX53 Olympus    
L-glutamine Gibco 25030-024  
LabTek II 8 wells  Nunc 154534  
Laemmli 2x Bio-Rad 1610737  
Laminin Corning 354232  
MaxQuant software (proteins identification software)     https://maxquant.net/maxquant/
MBT Polish stell Brucker 8268711  
MEM 10x Gibco 21090-022  
Methylcellulose Sigma-Aldrich M6385-100G  
MiliQ water Merck Millipore    
Milk Regilait REGILAIT300  
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell Bio-Rad 1658000FC  
MonoP FPLC column GE Healthcare   no longer available
Nanosight NS300 Malvern Panalytical NS300  
NanoSight NTA software v3.2 Malvern Panalytical    
NanoSight syringe pump Malvern Panalytical    
Neurobasal Gibco 21103-049  
Nitrocellulose membrane GE Healthcare 10600007  
Nonidet P-40 Fluka 56741  
Nunc multidish 24 wells ThermoFisher 82.1473  
Paraformaldehyde Electro microscopy Science 15713  
PC-12 cell line ATCC ATCC CRL-1721  
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122  
Peptide calibration mix LaserBio Labs C101  
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 115-035-003  
Perseus software (Processing of identified proteins)     https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate Santa-cruz sc-362065  
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830  
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190094 no calcium, no magnesium
pluriStrainer M/ 60 µm pluriSelect 43-50060  
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407  
Polycarbonate centrifuge tubes Beckman Coulter 355651  
Protease Inhibitor Sigma-Aldrich S8830-20TAB  
PureCol Cell Systems 5005  
Q-Exactive mass spectrometer ThermoFisher    
rapifleX mass spectrometer Brucker    
Rat cortical neurons Cell Applications R882N-20 Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium Cell Applications R620K-100 Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow
Rat primary macrophages Cell Applications R8818-10a  
Rat primary microglia Lonza RG535  
Sepharose CL-2B GE Healthcare 17014001  
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111  
Slide Dustsher 100204  
Sodium Chloride Scharlau SO0227  
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771  
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich S7920-100G  
Sodium hydroxide Scharlab SO0420005P  
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich S6422-100G  
SpeedVac Vacuum Concentrator ThermoFisher    
String software (functional protein association networks)     https://string-db.org/
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate ThermoFisher 34075  
Syringe 1.0 mL Terumo 8SS01H1  
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell Bio-Rad 1703940  
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508  
Tris Interchim UP031657  
Tris-Glycine Euromedex EU0550  
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287  
Ultracentrifuge Beckman Coulter A95765  
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti Beckman Coulter 342184  
Uranyl acetate Agar Scientific Ltd AGR1260A  
Whatman filter paper Sigma-Aldrich WHA10347510  
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma-Aldrich C2020-25G  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
  3. Sankowski, R., Mader, S., Valdes-Ferrer, S. I. Systemic Inflammation and the Brain: Novel Roles of Genetic, Molecular, and Environmental Cues as Drivers of Neurodegeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  4. Chakrabarty, S., Kabekkodu, S. P., Singh, R. P., Thangaraj, K., Singh, K. K., Satyamoorthy, K. Microglia in health and disease. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 43 (3), 25-29 (2015).
  5. Sankowski, R., Mader, S., Valdés-Ferrer, S. I. Systemic inflammation and the brain: novel roles of genetic, molecular, and environmental cues as drivers of neurodegeneration. Frontiers in cellular neuroscience. 9, 28 (2015).
  6. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  7. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  8. Domingues, P., et al. Tumor infiltrating immune cells in gliomas and meningiomas. Brain, Behavior, and Immunity. 53, 1-15 (2016).
  9. Hambardzumyan, D., Gutmann, D. H., Kettenmann, H. The role of microglia and macrophages in glioma maintenance and progression. Nature Neuroscience. 19 (1), 20-27 (2016).
  10. Thion, M. S., et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell. 172 (3), 500-516 (2018).
  11. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  12. Rajendran, L., et al. Emerging Roles of Extracellular Vesicles in the Nervous System. The Journal of Neuroscience. 34 (46), 15482-15489 (2014).
  13. Gupta, A., Pulliam, L. Exosomes as mediators of neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 11 (1), 68 (2014).
  14. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  15. Budnik, V., Ruiz-cañada, C., Wendler, F. Extracellular vesicles round off communication in the nervous system. Nature Reviews Neurosciences. 17, 160-172 (2016).
  16. Raffo-Romero, A., et al. Medicinal Leech CNS as a Model for Exosome Studies in the Crosstalk between Microglia and Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 19 (12), 4124 (2018).
  17. Zhou, Y., et al. Exosomes Transfer Among Different Species Cells and Mediating miRNAs Delivery. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (12), 4267-4274 (2017).
  18. Arab, T., et al. Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and OptiprepTM density gradient isolation. Journal of extracellular vesicles. 8 (1), 1603048 (2019).
  19. Murgoci, A. -N., et al. Brain-Cortex Microglia-Derived Exosomes: Nanoparticles for Glioma Therapy. ChemPhysChem. 19 (10), 1205-1214 (2018).
  20. Glebov, K., et al. Serotonin stimulates secretion of exosomes from microglia cells. Glia. 63 (4), 626-634 (2015).
  21. Hooper, C., et al. Wnt3a induces exosome secretion from primary cultured rat microglia. BMC Neuroscience. 13 (1), 144 (2012).
  22. Gabrielli, M., et al. Active endocannabinoids are secreted on extracellular membrane vesicles. EMBO reports. 16 (2), 213-220 (2015).
  23. Antonucci, F., et al. Microvesicles released from microglia stimulate synaptic activity via enhanced sphingolipid metabolism. The EMBO Journal. 31 (5), 1231-1240 (2012).
  24. Frühbeis, C., Fröhlich, D., Kuo, W. P., Krämer-Albers, E. -M. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 182 (2013).
  25. Prada, I., et al. Glia-to-neuron transfer of miRNAs via extracellular vesicles: a new mechanism underlying inflammation-induced synaptic alterations. Acta neuropathologica. 135 (4), 529-550 (2018).
  26. Takenouchi, T., et al. Extracellular ATP induces unconventional release of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from microglial cells. Immunology Letters. 167 (2), 116-124 (2015).
  27. Yang, Y., Boza-Serrano, A., Dunning, C. J. R., Clausen, B. H., Lambertsen, K. L., Deierborg, T. Inflammation leads to distinct populations of extracellular vesicles from microglia. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 168 (2018).
  28. Duhamel, M., et al. Paclitaxel Treatment and Proprotein Convertase 1/3 (PC1/3) Knockdown in Macrophages is a Promising Antiglioma Strategy as Revealed by Proteomics and Cytotoxicity Studies. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1126-1143 (2018).
  29. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. Journal of Neuroscience Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
  30. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
  31. Rashed, M. H., et al. Exosomes: From Garbage Bins to Promising Therapeutic Targets. Int. J. Mol. Sci. Int. J. Mol. Sci. 18 (18), (2017).
  32. Yuana, Y., Sturk, A., Nieuwland, R. Extracellular vesicles in physiological and pathological conditions. Blood Reviews. 27 (1), 31-39 (2013).
  33. Frohlich, D., et al. Multifaceted effects of oligodendroglial exosomes on neurons: impact on neuronal firing rate, signal transduction and gene regulation. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).
  34. Krämer-Albers, E. -M., et al. Oligodendrocytes secrete exosomes containing major myelin and stress-protective proteins: Trophic support for axons. Proteomics. Clinical applications. 1 (11), 1446-1461 (2007).
  35. Verderio, C., et al. Myeloid microvesicles are a marker and therapeutic target for neuroinflammation. Annals of Neurology. 72 (4), 610-624 (2012).
  36. Prada, I., Furlan, R., Matteoli, M., Verderio, C. Classical and Unconventional Pathways of Vesicular Release in Microglia. GLIA. 61, 1003-1017 (2013).
  37. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  38. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. , (2017).
  39. Kennedy, B. C., et al. Tumor-Associated Macrophages in Glioma: Friend or Foe. Journal of Oncology. 2013, 1-11 (2013).
  40. Potolicchio, I., Carven, G. J., Xu, X., Stipp, C., Riese, R. J., Stern, L. J., Santambroggio, L. Proteomic Analysis of Microglia-Derived Exosomes: Metabolic Role of the Aminopeptidase CD13 in Neuropeptide Catabolism1. The Journal of Immunology. 175, 2237-2243 (2005).
  41. Turola, E., Furlan, R., Bianco, F., Matteoli, M., Verderio, C. Microglial microvesicle secretion and intercellular signaling. Frontiers in Physiology. 3, (2012).
  42. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes : shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends in Cell Biology. 25 (6), 364-372 (2015).
  43. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  44. de Vrij, J., et al. Glioblastoma-derived extracellular vesicles modify the phenotype of monocytic cells. International Journal of Cancer. 137 (7), 1630-1642 (2015).
  45. van der Vos, K. E., et al. Directly visualized glioblastoma-derived extracellular vesicles transfer RNA to microglia/macrophages in the brain. Neuro-Oncology. 18 (1), 58-69 (2016).

Tags

Nevrovitenskap Problem 160 Immunfunksjoner microglia makrofager nevroner gliomceller ekstracellulære vesikler
Karakterisering av immuncellede ekstracellulære vesikler og studere funksjonell innvirkning på cellemiljø
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lemaire, Q., Duhamel, M.,… More

Lemaire, Q., Duhamel, M., Raffo-Romero, A., Salzet, M., Lefebvre, C. Characterization of Immune Cell-derived Extracellular Vesicles and Studying Functional Impact on Cell Environment. J. Vis. Exp. (160), e60118, doi:10.3791/60118 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter