यूवी-विस और एंटी-मलेरिया प्राइमाक्विन के नग्न-आंख निर्धारण के लिए अनुकूलित ग्रिस रिएक्शन
Summary
इस प्रोटोकॉल सिंथेटिक मूत्र और मानव serums में antimalarial प्राइमक्विन (PMQ) का पता लगाने के लिए एक उपन्यास colorimetric विधि का वर्णन करता है.
Abstract
प्राइमाक्वीन (पीएमक्यू), एक महत्वपूर्ण मलेरिया रोधी दवा, विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) द्वारा पी वाइवक्स और अंडाकारके कारण जीवन-धमकी देने वाले संक्रमणों के उपचार के लिए सिफारिश की गई है। हालांकि, PMQ अवांछित प्रतिकूल प्रभाव है कि ग्लूकोज-6-फॉस्फेट dehydrogenase (G6PD) की कमी के साथ रोगियों में तीव्र हेमोलिसिस के लिए नेतृत्व किया है. खुराक की निगरानी के उद्देश्य के साथ PMQ निर्धारण के लिए सरल और विश्वसनीय तरीकों को विकसित करने की आवश्यकता है. जल्दी में 2019, हम एक यूवी-Vis और नग्न आँख PMQ colorimetric परिमाणीकरण के लिए आधारित दृष्टिकोण की सूचना दी है. पता लगाने के रंग का azo उत्पादों उत्पन्न कर सकते हैं जो PMQ और anilines, के बीच एक Gries की तरह प्रतिक्रिया पर आधारित था. सिंथेटिक मूत्र में PMQ के प्रत्यक्ष माप के लिए पता लगाने की सीमा नैनोमोलर रेंज में है। इसके अलावा, इस विधि नैदानिक रूप से प्रासंगिक सांद्रता में मानव सीरम नमूनों से PMQ परिमाणीकरण के लिए महान क्षमता दिखाया गया है. इस प्रोटोकॉल में, हम syntheses और रंगीन azo उत्पादों की विशेषता के बारे में तकनीकी विवरण का वर्णन करेंगे, अभिकर्मक तैयारी, और PMQ निर्धारण के लिए प्रक्रियाओं.
Introduction
पीएमक्यू सबसे महत्वपूर्ण मलेरिया रोधी दवाओं में से एक है , यह न केवल पतन को रोकने के लिए एक ऊतक शाइजोंटोसाइड के रूप में काम करता है बल्कि रोग संचरण1,2,3,4को बाधित करने के लिए एक गेम्टोसाइटोसाइड के रूप में भी काम करता है । इंट्रावास्कुलर हेमोलिसिस पीएमक्यू के दुष्प्रभावों से संबंधित में से एक है, जो G6PD में कमी वाले लोगों में बेहद गंभीर हो जाता है। यह ज्ञात है कि G6PD आनुवंशिक विकार मलेरिया स्थानिकमारी क्षेत्रों में 3-30% के बीच एक जीन आवृत्ति के साथ दुनिया भर में वितरित किया जाता है. PMQ कमजोरी की गंभीरता G6PD की कमी की डिग्री के साथ ही खुराक और PMQ जोखिम5,6 की अवधि पर निर्भर करताहै. जोखिम को कम करने के लिए, डब्ल्यूएचओ ने मलेरिया के उपचार के लिए पीएमक्यू की एक कम खुराक (0.25 मिलीग्राम बेस/किलोग्राम) की सिफारिश की है। तथापि, यह अभी भी रोगी दवा संवेदनशीलता5,7 में बदलाव से चुनौती दीहै. खुराक निगरानी PMQ प्रशासन के बाद फार्माकोकाइनेटिक्स का आकलन करने के लिए आवश्यक है, जो सीमित विषाक्तता के साथ एक सफल उपचार के लिए खुराक समायोजन को प्रभावित कर सकता है।
उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) PMQ नैदानिक दृढ़ संकल्प के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीक है. Endoh एट अल एक सी-18 बहुलक जेल कॉलम8का उपयोग कर सीरम PMQ परिमाणीकरण के लिए एक यूवी डिटेक्टर के साथ एक HPLC प्रणाली की सूचना दी. उनके सिस्टम में, सीरम प्रोटीन पहले एसीटोनिट्रिल के साथ वेग से थे, और फिर सुपरनेंट में पीएमक्यू को एचपीएलसी के लिए अलग किया गया था। अंशांकन वक्र सांद्रता श्रेणी से 0ण्01-1ण्0 g/mL8से अधिक रेखीय था। 254 एनएम पर यूवी डिटेक्शन के साथ रिवर्स फेज एचपीएलसी पर आधारित एक अन्य विधि पीएमक्यू और इसके प्रमुख चयापचयों9के परिमाणीकरण के लिए सूचित की गई है। PMQ के लिए अंशांकन वक्र 0.025-100 g/mL के बीच की श्रेणी में रैखिक था। मिश्रित हेक्सेन और एथिल एसीटेट के साथ एक अतिरिक्त तरल-तरल निष्कर्षण जैविक चरण के रूप में PMQ जुदाई के लिए इस्तेमाल किया गया था प्रतिशत वसूली के साथ 89%9तक पहुँच गया। हाल ही में, मिरांडा एट अल 3 डिग्री / एमएल10पर एक पहचान सीमा के साथ गोली योगों में PMQ विश्लेषण के लिए 260 एनएम पर यूवी का पता लगाने के साथ एक UPLC विधि विकसित की है।
हालांकि HPLC तरीकों दवा निर्धारण में आशाजनक संवेदनशीलता प्रदर्शन और संवेदनशीलता आगे सुधार किया जा सकता है अगर HPLC एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर से लैस है, वहाँ अभी भी कुछ नुकसान कर रहे हैं. जैविक तरल पदार्थ में प्रत्यक्ष दवा माप आमतौर पर HPLC द्वारा दुर्गम हैं, के बाद से कई जैव अणुओं बहुत विश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं. एच . एल . सी विश्लेषण11,12से पहले अंतर्जात अणुओं को हटाने के लिए अतिरिक्त निष्कर्षणों की आवश्यकता होती है . इसके अलावा, एक HPLC-यूवी डिटेक्टर द्वारा PMQ का पता लगाने आम तौर पर अपनी अधिकतम अवशोषण तरंगदैर्ध्य (260 एनएम) पर किया जाता है. हालांकि, 260 एनएम (उदा., एमिनो एसिड, विटामिन, न्यूक्लिक एसिड और यूरोक्रोम पिगमेंट) में एक मजबूत अवशोषण के साथ जैविक तरल पदार्थ में कई अंतर्जात अणु हैं, इस प्रकार पीएमक्यू यूवी का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप कर ते। उचित संवेदनशीलता और चयनात्मकता के साथ PMQ निर्धारण के लिए सरल और लागत प्रभावी तरीकों को विकसित करने की आवश्यकता है।
ग्रिस प्रतिक्रिया पहली बार 1879 में नाइट्राइट का पता लगाने के लिए एक colorimetric परीक्षण के रूप में प्रस्तुत किया गया था13,14,15,16. हाल ही में , इस अभिक्रिया का व्यापक रूप से पता लगाया गया है कि न केवल नाइट्राइट बल्कि जैविक रूप से संबंधित अन्य अणुओं का भी पता लगाया जा सकताहै 17,18,19,20. हमने पहले पीएमक्यू के साथ अप्रत्याशित ग्रिस प्रतिक्रिया के पहले व्यवस्थित अध्ययन की सूचना दी है (चित्र 1)। इस प्रणाली में, PMQ रंगीन azos फार्म जब अम्लीय परिस्थितियों में नाइट्राइट आयनों की उपस्थिति में प्रतिस्थापित anilines के साथ युग्मित करने में सक्षम है. हमने यह भी पाया है कि ऐनिलाइन्स21पर प्रतिस्थापक के इलेक्ट्रॉन दान प्रभाव को बढ़ाते समय अज़ोस का रंग पीले से नीले रंग में होता है. पीएमक्यू परिमाणीकरण के लिए एक यूवी-विस अवशोषण आधारित रंगमितीय विधि को 4-मेथॉक्सीलाइन और पीएमक्यू के बीच अनुकूलित प्रतिक्रिया के माध्यम से विकसित किया गया है। इस विधि जैव प्रासंगिक तरल पदार्थ में PMQ के संवेदनशील और चयनात्मक पता लगाने के लिए महान क्षमता दिखाई है. यहाँ, हम इस colorimetric रणनीति के आधार पर PMQ निर्धारण के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं का वर्णन करना है.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम सुविधाजनक PMQ परिमाणीकरण के लिए एक colorimetric विधि का वर्णन किया. यह संभवतः सबसे सरल और लागत प्रभावी वर्तमान विधि है. इससे भी महत्वपूर्ण बात, इस विधि प्रदान करता है किसी भी उपकरण का उपयोग किए बिना नग्न आँख आधा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकचीनी चिकित्सा के गुआंग्झू विश्वविद्यालय से स्टार्ट-अप ग्रांट और जीजेडयूसीएम (2019QNPY06) के युवा वैज्ञानिक अनुसंधान प्रशिक्षण परियोजना को स्वीकार करते हैं। हम भी सुविधाओं पर समर्थन के लिए चीनी चिकित्सा के गुआंग्झू विश्वविद्यालय के Lingnan चिकित्सा अनुसंधान केंद्र स्वीकार करते हैं.
Materials
| 4-Methoxyaniline | Aladdin | K1709027 | |
| 2,4-Dimethoxyaniline | Heowns | 10154207 | |
| 3,4-Dimethoxyaniline | Bidepharm | BD21914 | |
| 4-Methylaniline | Adamas-beta | P1414526 | |
| 4-Nitroaniline | Macklin | C10191447 | |
| 96-wells,Flat Botton | Labserv | 310109008 | |
| Gaussian@16 software | Gaussian, Inc | Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux | |
| Hydrochloric acid | GCRF | 20180902 | |
| Marvin sketch (software) | CHEMAXON | free edition: 15.6.29 | |
| Phosphoric acid | Macklin | C10112815 | |
| Primaquine bisiphosphate | 3A Chemicals | CEBK200054 | |
| Sodium nitrite | Alfa Aesar | 5006K18R | |
| Sulfonamides | TCI(shanghai) | GCPLO-BP | |
| Varioskan LUX Plate reader | Thermo Fisher | Supplied with SkanIt Software 4.1 |
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