Primäre Kultur der Neuronen isoliert von Embryonal Mouse Cerebellum
Summary
Die Durchführung von In-vitro-Experimenten, um in vivo-Bedingungen so angemessen wie möglich zu reflektieren, ist keine leichte Aufgabe. Die Verwendung von primären Zellkulturen ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis der Zellbiologie in einem ganzen Organismus. Das bereitgestellte Protokoll beschreibt, wie man erfolgreich wachsen und Kultur embryonale Maus Kleinhirn Neuronen.
Abstract
Die Verwendung von primären Zellkulturen ist zu einem der wichtigsten Instrumente geworden, um das Nervensystem in vitro zu untersuchen. Das ultimative Ziel dieses vereinfachten Modellsystems ist es, eine kontrollierte Mikroumgebung zu schaffen und die hohe Überlebensrate und die natürlichen Merkmale dissoziierter neuronaler und nicht neuronaler Zellen so weit wie möglich unter In-vitro-Bedingungen aufrechtzuerhalten. In diesem Artikel zeigen wir eine Methode, primär Neuronen vom sich entwickelnden Maus-Kleinhirn zu isolieren, sie in eine In-vitro-Umgebung zu stellen, ihr Wachstum zu etablieren und ihre Lebensfähigkeit und Differenzierung für mehrere Wochen zu überwachen. Diese Methode gilt für embryonale Neuronen, die zwischen den embryonalen Tagen 12–18 vom Kleinhirn getrennt sind.
Introduction
Seit mehreren Jahrzehnten werden Zelllinien als Werkzeug mit hohem Durchsatz in präklinischen Studien und biologischer Forschung eingesetzt. Kostenwirksamkeit, schnelles Wachstum und Reduzierung des Einsatzes lebender Tiere sind einige Vorteile der Verwendung dieser Zellen. Jedoch, genetische Veränderungen und phänotypische Veränderungen akkumulieren nach mehreren Passagen in vitro1. Die falsche Identifizierung von Zelllinien und genetische Unähnlichkeit enden von Primärzellen können zu nicht reproduzierbaren Experimenten und falschen Schlussfolgerungen2,3,4,5führen. Daher können neuronale Zelllinien trotz einiger Ähnlichkeiten mit differenzierten Zellen wie Neuronen (z. B. Neurotransmitter, Ionenkanäle, Rezeptoren und andere neuronspezifische Proteine) nicht den vollständigen Phänotyp von Neuronen replizieren. Die Verwendung von reifen Neuronen ist eine weitere Option; Diese Zellen sind jedoch nicht dividierende postmitotische Zellen, die in der Kultur nur schwer zu verbreiten sind. Darüber hinaus kann der Wiedereintritt in den Zellzyklus apoptosis6ausbrechen.
Dreidimensionale (3D) Zellkultur, organotypische Scheibenkulturen und organoide Kulturen wurden entwickelt, um eine Umgebung zu schaffen, in der Zellen sich in eine 3D-Form anordnen können, die die in vivo-Einstellung imitiert. So können Zell-zu-Zell-Kommunikation, Migration, Invasion von Tumorzellen in umliegende Gewebe und Angiogenese untersucht werden7. Zusätzliche Kosten für die Verwendung von Extra-Zellmatrix-Proteinen (ECM) oder synthetischen Hydrogelen als Einstreu, Schwierigkeiten bei der Bildgebung und Kompatibilität mit Hochdurchsatz-Screening-Instrumenten sind jedoch erhebliche Nachteile der 3D-Zellkultivierung. Ein großer Nachteil der organotypischen Gewebescheibenkultur ist die Verwendung einer großen Anzahl von Tieren und die negativen Auswirkungen der Axotomie, die zu unzugänglichkeit von Zielen und Wachstumsfaktoren für Axone führt, und folglich neuronalen Tod8.
Daher ist ein alternativer Ansatz, der die Probleme mit Zelllinien, die Schwierigkeit des Wachsens reifer Zellen und die Komplexität von Geweben vermeidet, die In-vitro-Reifung unreifer Primärzellen. Primärzellen werden direkt aus menschlichem oder tierischem Gewebe abgeleitet und mit enzymatischen und/oder mechanischen Methoden dissoziiert9. Die Hauptprinzipien der Isolierung, Aussaat und Wartung im Kulturmedium sind unabhängig von der Gewebequelle ähnlich. Die trophischen Faktoren, die zur Förderung der Proliferation und Reifung notwendig sind, sind jedoch hochzellspezifisch6.
Das Wissen um das Geburtsdatum jedes Kleinhirnzelltyps ist eine Voraussetzung für die Gestaltung eines primären Kulturexperiments. Im Allgemeinen werden Purkinje-Zellen (PCs) und die Neuronen der Kleinhirnkerne (CN) vor den kleineren Zellen geboren, einschließlich Interneuronen (z. B. Korb, stellate Zellen) und Granulatzellen. Bei Mäusen entstehen PCs zwischen dem embryonalen Tag (E)10–E13, während CN-Neuronen bei etwa E9–E1210liegen.
Andere Kleinhirn-Neuronen werden viel später geboren. Bei Mäusen wird z. B. die Golgi-Subpopulation von Interneuronen aus VZ bei (E14-E18) erzeugt, und die verbleibenden Interneuronen (Korbzellen und stellate Zellen), die sich in der molekularen Schicht befinden, entstehen aus der Teilung von Vorläuferzellen in der weißen Materie zwischen postnatal (P)0–P711. Granulatzellen werden aus der äußeren Keimzone (EGZ) erzeugt, einer sekundären Keimzone, die aus der rostralen Rhombenlippe abgeleitet wird und nach der Geburt durch terminale Teilung geht. Doch bevor ihre Vorläufer aus der rhomben Lippe von E13–E16 entstehen, sind die Zellen bereits rostral entlang der Pia-Oberfläche gewandert, um eine dünne Zellschicht auf der dorsalen Oberfläche der Kleinhirnanlage zu bilden. Nichtneuronale makrogliale Zellen wie Astrozyten und Oligodendrozyten, die aus dem ventrikulären Neuroepithel stammen, werden bei E13,5-P0 bzw. P0-P7 bzw.11,12,13,14 ,15. Mikroglia werden von eigelb-sac primitiven myeloischen Vorläuferzellen zwischen E8–E10 abgeleitet und nach einer Invasion in das zentrale Nervensystem kann im Mausgehirn von E916nachgewiesen werden.
Die in diesem Artikel vorgestellte Methode basiert auf der Methode, die ursprünglich von Furuya et al. und Tabata et al.17,18entwickelt wurde und für die primäre Kultivierung von Purkinje-Zellen optimiert wurde, die von Wistar rat cerebella abgeleitet wurden. Wir haben diese Methode nun angepasst und sorgfältig modifiziert, um das Wachstum von Maus-Kleinhirnneuronen zu untersuchen19. Anders als in unserem neuen Protokoll ist das Kaltstungsmedium der Hauptwaschpuffer, der bei Sezier- und Dissoziationsschritten verwendet wird, bevor im Furuya-Protokoll17das Saatmedium hinzugefügt wird. Dieser Puffer fehlt die Ernährung, Wachstumsfaktoren, und Hormone (alle in Dulbecco modifiziert Eagle Medium: Nährstoffmischung F-12 [DMEM/F12]), die notwendig sind, um Zellwachstum und Überleben während der oben genannten Schritte zu unterstützen. Darüber hinaus haben wir auf der Grundlage unserer langjährigen Erfahrung mit murinen primären Kleinhirnkulturen in jedem Brunnen 500 l Kulturmedium (anstelle von 1 ml) verwendet und die Triiodothyroninkonzentration auf 0,5 ng/ml erhöht, was das Wachstum neuronaler Zellen in insbesondere solche mit einem Purkinje-Zell-Phänotyp, und fördert das Wachstum der dendritischen Zweige in der Kultur. Die in diesem Artikel vorgestellte Hauptmethode kann während der embryonalen Entwicklung weitgehend auf andere kleine Nagetiere (z. B. Eichhörnchen und Hamster) angewendet werden und kann zur Untersuchung der Kleinhirnneurogenese und -differenzierung in den verschiedenen embryonalen Stadien verwendet werden, die von Art zu Art unterschiedlich sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Verwendung von Primärkulturen ist eine bekannte Methode, die für alle Arten von Neuronen17,18,19anwendbar ist. Im vorgestellten Protokoll erklären wir, wie man Kleinhirnneuronen isoliert und ihre Lebensfähigkeit mit optimalem Überleben in vitro für maximal 3 Wochen aufrechterhält. Die Primärkultur von Kleinhirnzellen, die bei E15-E18 isoliert wurden, bestätigt die Sammlung von drei Klassen großer Neuronen: PCs, Gol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studien wurden durch Stipendien des Natural Sciences and Engineering Research Council (HM: NSERC Discovery Grant – RGPIN-2018-06040) und des Children Hospital Research Institute of Manitoba (HM: Grant Nr. 320035) und des ALS Canada-Brain Canada Arthur J. unterstützt. Hudson Translational Team Grant (JK, HM).
Materials
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | fisher scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
Referências
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