Embriyonik Fare Beyincisinden İzole Edilen Nöronların Birincil Kültürü
Summary
In vitro deneylerin vivo koşullarını mümkün olduğunca yeterli şekilde yansıtmak için yapılması kolay bir iş değildir. Birincil hücre kültürlerinin kullanımı bütün bir organizmada hücre biyolojisini anlamaya yönelik önemli bir adımdır. Sağlanan protokol nasıl başarılı bir şekilde büyümek ve kültür embriyonik fare serebellar nöronlar özetliyor.
Abstract
Birincil hücre kültürlerinin kullanımı in vitro sinir sistemini incelemek için önemli araçlardan biri haline gelmiştir. Bu basitleştirilmiş model sistemini kullanmanın nihai amacı kontrollü bir mikroçevre sağlamak ve yüksek sağkalım oranını ve ayrıştırılmış nöronal ve nöronal olmayan hücrelerin doğal özelliklerini in vitro koşullarda mümkün olduğunca korumaktır. Bu makalede, gelişmekte olan fare beyincik birincil nöronlar izole bir yöntem göstermek, bir in vitro ortamda yerleştirerek, onların büyüme kurulması, ve birkaç hafta için canlılık ve farklılaşma izleme. Bu yöntem 12-18 yılları arasında serebellumdan ayrıştırılan embriyonik nöronlar için geçerlidir.
Introduction
Birkaç on yıl için, hücre hatları yaygın preklinik çalışmalar ve biyolojik araştırmalarda yüksek iş aracı olarak kullanılmaktadır. Maliyet etkinliği, hızlı büyüme ve canlı hayvan kullanımının azaltılması bu hücreleri kullanarak bazı faydaları vardır. Ancak, genetik değişiklikler ve fenotipik değişiklikler in vitro1birkaç pasajlar sonra birikir. Hücre hatlarının yanlış tanımlanması ve birincil hücrelerden genetik farklılık geri dönüşü olmayan deneylere ve yanlışsonuçlarayol açabilir 2,3,4,5. Bu nedenle, nöronlar gibi farklılaşmış hücrelere bazı benzerlikler rağmen (örneğin, nörotransmitter, iyon kanalları, reseptörler, ve diğer nöron özgü proteinler), nöronal hücre hatları nöronların tam fenotip çoğaltmak olamaz. Olgun nöronlar kullanarak başka bir seçenektir; ancak, bu hücreler kültürde yaymak zor olan bölünemeyen postmitotik hücrelerdir. Ayrıca hücre döngüsüne yeniden giriş apoptoz6’yaneden olabilir.
Üç boyutlu (3D) hücre kültürü, organotipik dilim kültürleri ve organoid kültürler, hücrelerin in vivo ayarı taklit eden bir 3D forma düzenleyebileceği bir ortam sağlamak için geliştirilmiştir. Böylece hücre-hücre iletişimi, göç, tümör hücrelerinin çevre dokulara invazyonu ve anjiyogenez7incelenebilir. Ancak, ekstra hücresel matriks (ECM) proteinleri veya sentetik hidrojelleri yatak olarak kullanmanın ek maliyetleri, görüntülemede zorluk ve yüksek iş yapma lı tarama aletleriyle uyumluluk 3D hücre culturing önemli dezavantajları vardır. Organotipik doku dilimi kültürünün önemli bir dezavantajı hayvanların çok sayıda kullanımı ve aksitomi yan etkileri, hangi hedeflerve aksonlar için büyüme faktörlerinin erişilemezliği yol açar, ve sonuç olarak nöronal ölüm8.
Bu nedenle, hücre hatları ile ilgili sorunları önler alternatif bir yaklaşım, olgun hücrelerin büyüyen zorluk, ve dokuların karmaşıklığı, olgunlaşmamış primer hücrelerin in vitro olgunlaşma olduğunu. Birincil hücreler doğrudan insan veya hayvan dokusundan türetilir ve enzimatik ve/veya mekanik yöntemlerle ayrıştırılır9. Kültür ortamında izolasyon, tohumlama ve bakım temel ilkeleri doku kaynağı ne olursa olsun benzerdir. Ancak, proliferasyon ve olgunlaşmayı teşvik etmek için gerekli trofik faktörler yüksek hücre spesifik6.
Her serebellar hücre tipinin ‘doğum tarihini’ bilmek bir birincil kültür deneyi tasarlamak için bir ön koşuldur. Genel olarak, Purkinje hücreleri (PCs) ve serebellar çekirdeklerin nöronlar (CN), internöronlar da dahil olmak üzere küçük hücreler, önce doğarlar (örneğin, sepet, stellat hücreleri) ve granül hücreler. Farelerde, bilgisayarlar embriyonik gün (E)10-E13 arasında ortaya çıkarken, CN nöronlar yaklaşık E9-E1210.
Diğer serebellar nöronlar çok daha sonra doğarlar. Örneğin, farelerde, internöronların Golgi alt popülasyonu VZ’den (~E14−E18) üretilir ve moleküler tabakada bulunan kalan internöronlar (sepet hücresi ve yıldız hücreleri) beyaz maddedeki progenitor hücrelerinin erken ile beyaz maddeye bölünmesinden ortaya çıkar. doğum sonrası (P)0–P711. Granül hücreler dış germinal zon (EGZ), rostral rhombic dudak türetilen ve doğumdan sonra terminal bölümü geçer ikincil bir germinal zon üretilir. Ancak öncülleri E13-E16’dan gelen eşkenar dörtgen dudaktan doğmadan önce, hücreler serebel ange’nin dorsal yüzeyinde ince bir hücre tabakası yapmak için pia yüzeyi boyunca rostrally göç etmişler. Ventriküler nöroepitelkökenli astrositler ve oligodendrositler gibi nöronal olmayan makroglial hücreler sırasıyla E13.5−P0 ve P0−P7’de doğarlar11,12,13,14 ,15. Mikroglia e8-E10 arasında yolk-kese ilkel miyeloid atahücreleri türetilmiştir ve merkezi sinir sistemine invazu sonrası E916ile fare beyninde tespit edilebilir .
Bu makalede sunulan yöntem aslında Furuya ve ark. ve Tabata ve ark.17,18tarafından geliştirilen bir dayanmaktadır , Wistar sıçan cerebella türetilen Purkinje hücrelerinin birincil culturing için optimize edildi. Şimdi bu yöntemi adapte ve dikkatle fare serebellar nöronların büyümesini incelemek için modifiye19. Yeni protokolümüzden farklı olarak, soğuk diseksiyon ortamı Furuya protokolü17’yetohumlama ortamı eklemeden önce diseksiyon ve dissosilasyon basamaklarında kullanılan ana yıkama tamponudur. Bu tampon beslenme yoksun, büyüme faktörleri, ve hormonlar (Dulbecco değiştirilmiş Eagle orta tüm: besin karışımı F-12 [DMEM/F12]) bu yukarıda belirtilen adımlar sırasında hücre büyümesini ve sağkalım desteklemek için gerekli olan. Buna ek olarak, murine primer serebellar kültürleri ile ilgili geniş deneyimimize dayanarak, her kuyuda (1 mL yerine) 500 μL kültür ortamı kullandık ve nöronal hücrelerin büyümesini iyileştiren tri-iyototironin konsantrasyonunu 0,5 ng/mL’ye çıkardık. özellikle purkinje hücre fenotip olanlar, ve kültürde dendritik dalların büyümesini teşvik. Bu makalede yer alan temel yöntem, embriyonik gelişim sırasında diğer küçük kemirgenlere (örneğin, sincaplar ve hamsterlar) yaygın olarak uygulanabilir ve çeşitli embriyonik evrelerde serebellar nörogenezve farklılaşmayı incelemek için kullanılabilir, türler arasında farklılık gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Birincil kültürlerin kullanımı nöronların her türlü için geçerli iyi bilinen bir yöntemdir17,18,19. Sunulan protokolde, serebellar nöronların nasıl izole edilebildiğini ve en fazla 3 hafta boyunca optimum in vitro sağkalımla canlılıklarını nasıl koruyacağımızı açıklıyoruz. E15−E18’de izole edilen serebellar hücrelerinin birincil kültürü, büyük nöronların üç sınıfının toplanmasını do…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmalar, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (HM: NSERC Discovery Grant # RGPIN-2018-06040) ve Manitoba Çocuk Hastanesi Araştırma Enstitüsü (HM: Grant # 320035) ve ALS Canada-Brain Canada Arthur J.’den gelen hibelerle desteklenmiştir. Hudson Çeviri Takım Grant (JK, HM).
Materials
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | fisher scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
Referências
- Giffard, R. G., Ouyang, Y. B., Squire, L. R. Cell culture: primary neural cells. Encyclopedia of Neuroscience. , 633-637 (2009).
- Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines. PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Capes-Davis, A., et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neurociência. 305, 86-98 (2015).
- Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. Cell culture: primary neural cells. Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , (2017).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).
- Sudarov, A., et al. Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly. Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).
- Rahimi-Balaei, M., et al. Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice. Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal Migration During Development of the Cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Buffo, A., Rossi, F. Origin, lineage and function of cerebellar glia. Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development. Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).
- Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research. Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).
- Tabata, T., et al. A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons. Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
- Schaller, K. L., Caldwell, J. H. Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum. Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- van der Valk, J., Gstraunthaler, G. Fetal Bovine Serum (FBS) – A pain in the dish. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).
- Froud, S. J. The development, benefits and disadvantages of serum-free media. Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).
- Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells. Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).
- Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A., Barh, D., Azevedo, V. Cell and tissue culture: the base of biotechnology. Omics Technologies and Bio-Engineering. , 391-429 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).
- Nelson, K. B., Bauman, M. L. Thimerosal and autism. Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
