התרבות הראשית של הנוירונים מבודדים מתוך עכבר ממוח עובריים
Summary
ניהול ניסויים בלתי מתורבת כדי לשקף את התנאים הvivo ככל האפשר, אינו משימה קלה. השימוש בתרביות תאים ראשונית הוא צעד חשוב להבנת הביולוגיה התאית באורגניזם שלם. הפרוטוקול שסופקו מתאר כיצד לצמוח בהצלחה תרבות עובריים העכבר מתחלקים נוירונים.
Abstract
השימוש בתרביות תאים ראשונית הפך לאחד הכלים העיקריים לחקר מערכת העצבים בתחומי החוץ. המטרה האולטימטיבית של שימוש במערכת מודל פשוטה זו היא לספק סביבת מיקרו מבוקרת ולשמור על שיעור ההישרדות הגבוה ואת התכונות הטבעיות של תאים עצביים הופלו ושאינם עצביים ככל האפשר תחת בתנאי מבחנה. במאמר זה, אנו מדגימים שיטה של בידוד הנוירונים העיקריים מתוך המוח הראשי מתפתח העכבר, הצבת אותם בסביבה מבחנה, הקמת הצמיחה שלהם, ניטור הכדאיות שלהם בידול במשך מספר שבועות. שיטה זו ישימה הנוירונים עובריים המנתק המוח בין הימים העובריים 12 – 18.
Introduction
במשך כמה עשורים, קווי התא שימשו באופן נרחב ככלי תפוקה גבוהה במחקרים פרה-קליניים ומחקר ביולוגי. עלות-תועלת, צמיחה מהירה, והפחתה של השימוש בעלי חיים חיים הם כמה יתרונות של שימוש בתאים אלה. עם זאת, שינויים גנטיים ופנוטיטינוים מצטברים לאחר מספר פסקאות בתוך מבחנה1. מקריות של קווי תאים וdissimilarity גנטיים מתאים ראשוניים יכולים להוביל לניסויים בחוסר הזדהות ולמסקנות כוזבות2,3,4,5. לכן, למרות קווי דמיון מסוימים כדי הבדיל תאים כגון נוירונים (למשל, נוירוטרנסמיטורים, ערוצי יון, קולטנים, וחלבונים אחרים בתאי העצב), קווי התאים עצביים לא יכול לשכפל את הפנוטיפ מלא של נוירונים. שימוש בנוירונים מבוגרים הוא אופציה אחרת; עם זאת, תאים אלה אינם מחלקים postmitotic תאים שקשה להפיץ בתרבות. יתר על כן, כניסה מחדש לתוך מחזור התא עשוי לזרז אפופטוזיס6.
תרבות תא תלת מימדי (3D), תרביות פרוסה אורגנותמית, ותרבויות אורגנואיד פותחו כדי לספק סביבה שבה תאים יכולים לסדר לתוך טופס 3D המחקה את vivo הגדרה. כך, תקשורת תא אל התא, הגירה, פלישה של תאים סרטניים לתוך הרקמות הסובבות, ו אנגיוגנזה ניתן ללמוד7. עם זאת, עלויות נוספות של שימוש מטריצה סלולרית נוספת (ECM) חלבונים או הידרוג’לים סינתטיים כמצע, קושי הדמיה, ותאימות עם מכשירי סינון תפוקה גבוהה הם חסרונות ניכרים של תא 3D culturing. חיסרון משמעותי בתרבות הפרוסה של רקמת הרקמה הוא השימוש במספר רב של בעלי חיים ובהשפעות השליליות של הפיום, המוביל לנגישות של מטרות וגורמי גדילה לאקסונים, וכתוצאה מכך מוות עצבי8.
לכן, גישה חלופית, אשר מונעת את הבעיות עם קווי התאים, הקושי של הגידול תאים בוגרים, ומורכבות של רקמות, הוא התבגרות מתורבת של תאים ראשוניים לא בוגרים. התאים הראשוניים נגזרים ישירות מרקמת אדם או בעל חיים ומונתק בשיטות אנזימטיות ו/או מכניות9. העקרונות המרכזיים של בידוד, זריעה ותחזוקה במדיום התרבותי דומים ללא קשר למקור הרקמה. עם זאת, הגורמים ההזנה הדרושים כדי לקדם התפשטות והתבגרות הם מאוד מסוימים התא6.
לדעת את ‘ הלידה ‘ של כל סוג תא המוח הוא תנאי מוקדם לעיצוב ניסוי התרבות העיקרית. באופן כללי, התאים Purkinje (מחשבים אישיים) ואת הנוירונים של גרעיני המוח (CN), נולדים לפני התאים הקטנים, כולל interneurons (למשל, סל, תאים stellate) ותאי הגרניט. בעכברים, מחשבים מופיעים בין היום העובריים (E) 10 – E13, ואילו נוירונים CN ב כ E9 – E1210.
. מאוחר יותר נולדים המון נוירונים לדוגמה, בעכברים, אוכלוסיית המשנה של Golgi של האינטרנוירונים נוצרות מ-VZ ב (~ E14-E18) ושאר התאים הביננוירונים (תא סל ותאי stellate) הממוקמים בשכבה המולקולרית מגיחים מחלוקת תאים מחולל בחומר הלבן בין תחילת פוסט לנטאל (P) 0 – P711. תאי הגרניט מופקים מאזור נבטי חיצוני (EGZ), אזור נבטי משני שנגזר מהשפתיים הrostral מעובית ועובר דרך החטיבה הסופנית לאחר הלידה. אך לפני שהסמנים שלהם נובעים השפה מעובית מ E13 – E16, התאים כבר הועברו rostrally לאורך משטח הפיה כדי ליצור שכבה דקה של תאים על המשטח החלק הפנימי של אנאג המוח. תאי מקרוגליאל ללא עצבי כגון אסטרוציטים ו oligodendrocytes הפוך, אשר מקורם של נוירואפיתל המוח, נולדים ב e 13.5-P0 וP0-P7 בהתאמה11,12,13,14 ,בן 15 Microglia נגזרות של חלמון-שק מיאלואיד פרימיטיבי התאים בין E8 – E10 ולאחר הפלישה למערכת העצבים המרכזית ניתן לזהות במוח העכבר על ידי E916.
השיטה המוצגת במאמר זה מבוססת על האחד שפותח במקור על ידי furuya et al. ו tabata et al.17,18, אשר היה ממוטב עבור culturing העיקרי של תאים purkinje נגזר של חולדה עכברוש וויסטאר. יש לנו עכשיו להתאים את השיטה הזאת ושינה בקפידה אותו ללמוד את הצמיחה של העכבר מוח הנוירונים19. בניגוד לפרוטוקול החדש שלנו, מדיום לחיתוך קר הוא מאגר הכביסה העיקרי המשמש במהלך הניתוח ושלבי הדיסוציאציה לפני הוספת מדיום זריעה בפרוטוקול של פאראיה17. מאגר זה חסר את התזונה, גורמי גדילה, והורמונים (כל בינוני משתנה הנשר מדולקו: תערובת מזינים F-12 [Dמאמ/F12]) כי יש צורך לתמוך צמיחת תאים והישרדות במהלך השלבים הנ ל. בנוסף, בהתבסס על הניסיון הנרחב שלנו עם תרבויות המוח הראשי murine, השתמשנו 500 μl של התרבות הבינונית בכל טוב (במקום 1 mL) והגדילה את הריכוז tri-iothyronine כדי 0.5 ng/mL, אשר משפר את הצמיחה של תאים עצביים, ב במיוחד אלה עם תא מיוחד Purkinje, ומקדם את הצמיחה של ענפים דנדריטים בתרבות. השיטה העיקרית מובלט במאמר זה ניתן להחיל באופן כללי על מכרסמים קטנים אחרים (למשל, סנאים ואוגרים) במהלך פיתוח עובריים ניתן להשתמש כדי ללמוד נוירוגנזה המוח ובידול בשלבים העובריים השונים, אשר שונים בין המינים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השימוש בתרבויות הראשיות הוא שיטה ידועה הישימה עבור כל סוגי הנוירונים17,18,19. בפרוטוקול המוצג, אנו מסבירים כיצד לבודד נוירונים מקרבלאר ולשמור על הכדאיות שלהם עם הישרדות אופטימלית בתוך מבחנה מקסימלית של 3 שבועות. התרבות העיקרית של תאים המוח, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקרים אלה היו נתמכים על ידי מענקים מדעי הטבע ומועצת המחקר ההנדסה (HM: מענק דיסקברי NSERC RGPIN-2018-06040), וילדים החולים מחקר המכון של מניטובה (HM: גרנט 320035), ו-ALS קנדה-המוח קנדה ארתור J. צוות הדסון טרנסלtional גרנט (JK, HM).
Materials
| Adobe Photoshop CS5 Version 12 | Adobe Inc | ||
| Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6) | Sigma | S0438 | 3 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A3608 | |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Polyclonal) | CB38 | 1/5000 dilution |
| CALB1 | Swant Swiss Antibodies (Monoclonal) | 300 | 1/1000 dilution |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C) | Millipore Sigma | C1768 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Dressing Forceps | Delasco | DF-45 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM-F12) | Lonza | 12-719F | |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | fisher scientific | 12-545-81 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Insulin from bovine pancreas | Millipore sigma | I5500, I6634, I1882, and I4011 | |
| Large Scissor | Stoelting | 52134-38 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Metallized Hemacytometer | Hausser Bright-Line | 3100 | |
| Microdissection Forceps | Merlan | 624734 | |
| Pattern 5 Tweezer | Dixon | 291-9454 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher BioReagents | BP399-26 | |
| Poly-L-Ornithine | Millipore Sigma | P4638 | |
| Progesteron (P4) | Millipore sigma | P8783 | |
| PVALB | Swant Swiss Antibodies | 235 | 1/1500 dilution |
| Samll Scissor | WPI Swiss Scissors, 9cm | 504519 | |
| Sodium Selenite | Millipore Sigma | S9133 | |
| Transferrin | Millipore Sigma | T8158 | |
| Tri-iodothyronine (T3) | Millipore Sigma | T2877 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Zeiss Fluorescence microscope | Zeiss | Z2 Imager |
Referências
- Giffard, R. G., Ouyang, Y. B., Squire, L. R. Cell culture: primary neural cells. Encyclopedia of Neuroscience. , 633-637 (2009).
- Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines. PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).
- Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. Fixing problems with cell lines. Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Capes-Davis, A., et al. Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neurociência. 305, 86-98 (2015).
- Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. Cell culture: primary neural cells. Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , (2017).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).
- Sudarov, A., et al. Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly. Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).
- Rahimi-Balaei, M., et al. Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice. Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal Migration During Development of the Cerebellum. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).
- Buffo, A., Rossi, F. Origin, lineage and function of cerebellar glia. Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development. Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).
- Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research. Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).
- Tabata, T., et al. A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons. Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
- Schaller, K. L., Caldwell, J. H. Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum. Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).
- Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity. Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).
- van der Valk, J., Gstraunthaler, G. Fetal Bovine Serum (FBS) – A pain in the dish. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).
- Froud, S. J. The development, benefits and disadvantages of serum-free media. Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).
- Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells. Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).
- Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A., Barh, D., Azevedo, V. Cell and tissue culture: the base of biotechnology. Omics Technologies and Bio-Engineering. , 391-429 (2018).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).
- Nelson, K. B., Bauman, M. L. Thimerosal and autism. Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).
- Marzban, H., Hawkes, R. Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures. Brain Research. 1141, 25-36 (2007).
