Summary
该协议中提出的共区域互测定成本低廉、吞吐量高且简单。这些测定可用于观察共培养中的微生物相互作用，识别相互作用模式，并描述感兴趣的微生物菌株对人类和环境病原体的抑制潜力。
Abstract
对微生物之间相互作用的研究已经导致许多发现，从新的抗菌素到微生物生态学的见解。许多用于研究微生物相互作用的方法都需要专门的设备，而且费用昂贵，而且时间密集。本文提出了一种共培养相互作用检测的协议，该检测成本低廉，可扩展到大样本数，并且易于适应大量实验设计。微生物被培养在一起，每个井代表一对微生物的组合。测试生物在每口井的一侧培养，并在单一培养中首次孵育。随后，目标生物体同时接种到每口井的对面，使用3D打印的接种印章。共同培养后，完成测定对视觉表型（如生长或抑制）进行评分。这些测定法可用于确认表型或识别感兴趣的分离物中的模式。利用这种简单而有效的方法，用户可以快速有效地分析微生物的组合。这种共培养方法适用于抗生素发现和基于培养的微生物群研究，并已成功地应用于这两种应用。
Introduction
在自然界中，微生物很少孤立存在;因此，它们不断与其他生物相互作用。因此，研究微生物如何相互作用对于理解多种微生物行为至关重要。微生物相互作用可以是相互的、共的的或对立的。这些在三动性不仅影响微生物本身，而且影响微生物殖民1，2的环境和宿主。
许多科学家研究微生物相互作用，以识别新的抗菌分子。通过微生物相互作用的研究，发现了第一个临床上重要的抗菌分子。亚历山大·弗莱明爵士观察到一种污染性青霉素的分离物，它抑制了葡萄球菌菌株的生长，从而发现了常用的抗生素青霉素3。微生物用来对抗其竞争对手的机制的特性仍然是发现抗菌分子的富有成果的资源。例如，最近显示链球菌sp.菌株Mg1产生抗生素线霉素，对亚氏杆菌4具有溶性及降解活性。
此外，最近发现一种非核糖核酸合成的肽，名为lugdunin，经观察，鼻管金黄色葡萄球菌能抑制金黄色葡萄球菌5。研究还表明，微生物之间的相互作用与对抗性相互作用一样强大，对抗菌分子的发现也是如此。例如，许多真菌养殖蚂蚁在部落阿提尼窝着共生细菌称为伪诺卡迪亚在他们的外骨骼，产生抗真菌分子，以抑制其真菌作物的义务病原体6。由于微生物相互作用的研究有利于发现抗菌分子，使用高通量屏幕可能会导致发现新的抗菌分子。
在成本和性能方面，用于研究微生物相互作用的方法从简单到复杂不等。例如，琼脂塞测定是一种廉价而简单的方法，可用于研究多种微生物之间的对抗7。然而，琼脂塞测定不是一个有效的过程，对于许多成对组合来说，可能劳动密集型。为了以高通量的方式评估微生物生产的产品对目标分离物的影响，许多实验室使用磁盘扩散测定方法8。这些检测是容易和廉价的，可以扩展到更多的样本7。然而，这种测定需要生成微生物提取物，并可能产生误导性的结果，某些组合的目标生物和抗生素，如沙门氏菌和头孢菌素9。
上述方法依靠分离的成分在目标生物体中引起响应，而不是允许微生物相互相互作用。这是值得注意的，因为微生物之间的相互作用可能导致产生"神秘"的抗菌分子，这些分子不是在单一培养中产生的。例如，最近表明，抗菌键霉素只由微单体孢子产生，当与从同一海绵微生物群10分离的Rhodococcus sp.共同培养时。更复杂的交互方法规避了这种潜在的单一文化障碍。例如，iChip可用于从环境样本中分离稀有和难以培养的细菌，并允许通过原位11的生长来观察微生物相互作用。为了详细研究相互作用，可以使用矩阵辅助激光解吸/电光飞行成像质谱法（MALDI-TOF-IMS）。这种方法提供了关于小分子和肽的组成和分布的详细信息，这些小分子和肽是由与高空间分辨率相互作用的微生物菌落产生的。MALDI-TOF-IMS也被用于细菌相互作用的多种研究，以描述竞争机制12，13，14，15。然而，MALDI-TOF-IMS 通常需要费力的样品制备、操作设备的专业知识以及昂贵而专业的质谱仪。由于这些原因，它是一种难以用于高通量研究的技术。因此，针对微生物相互作用进行简单、可扩展和高通量的共同培养测定，克服了上述方法的许多局限性，将是有益的。
这里给出了高通量微生物共培养的协议。这种测定简单易入，并可轻松纳入微生物相互作用的预先存在的研究。与许多常用的微生物相互作用研究方法不同，我们的方法简单、价格低廉，适合研究大量的相互作用。这些检测不仅易于执行，而且材料可从大多数实验室供应商或公共资源（例如图书馆和制造商空间）广泛获得。因此，这种测定作为第一线调查，可以识别和分析许多微生物成对组合中的有趣模式，这对微生物生态学的调查可能特别有用。
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Protocol
获得捐赠者父母的知情同意，威斯康星大学麦迪逊分校的人类主体委员会批准了这项研究（机构审查委员会[IRB]批准文号H-2013-1044）。
1. 样本文化
注：此过程用于研究从人类鼻腔分离的细菌之间的相互作用。原则上，以下方法适用于任何文化条件。脑-心输液汤（BHI）用于鼻细菌的一般传播。所有板均使用 1.5% 琼脂进行凝固。在这项研究中，从盐水溶液中抽取样品，冲入供体的鼻子（鼻腔），转移到微离心管中，并在-80°C冷冻。
- 使用标准培养技术将每个解冻的洗漱样品的 100 μL 板板到 BHI 板上。
- 在37°C下有氧孵育板1周。
- 孵育后，选择每个不同形态的+2个菌落，通过从初始板将菌落从初始板条纹到新的BHI板上，并在37°C下孵育板，从而有氧地在BHI板上分离出。重复，直到细菌培养物是纯的。
注：细菌分离物可以通过菌群形态学、克染色、16S rRNA基因测序或其他方法进行识别。但是，了解隔离器的标识对于继续协议是不必要的。 - 在冷冻管中结合1 mL的50%甘油与1 mL的细菌过夜培养物（见第3节）后，在-80°C下保存所有细菌分离物。
2. 3D打印邮票
注：聚碳酸酯因其高玻璃过渡温度 （147 °C） 超过标准高压灭菌温度 （121 °C） 而被选为冲压材料，从而将重复使用后变形的可能性降至最低。
- 使用聚碳酸酯灯丝加载 3D 打印机。
- 在打印床上涂抹白色学校胶水（醋酸聚乙烯），以帮助粘附，并尽量减少印刷期间接种图章的翘曲。
- 加载 .STL模型文件 （补充数据文件） 接种图1） 进入 3D 打印机软件.
- 在 290°C 喷嘴温度、60°C 床温和 0.38 mm 层高度下打印接种图章。
- 将邮票包裹在铝箔中，在重力循环上通过高压灭菌进行1.5小时消毒，干燥15分钟。
注：虽然聚碳酸酯是吸湿的，但经过高压灭菌后，邮票仅保留约0.5%的水重。
3. 一夜文化的准备
- 使用血清学移液器，移液器 3 mL 无菌 BHI 汤放入 14 mL 培养管中。
- 使用无菌 1 μL 接种回路，将细菌菌群接种到肉汤中。旋转循环，以确保团块分散到肉汤中。在孵育前短暂地涡流培养管。
- 在 37°C （±16 h） 转速下在摇床上孵育培养管。
- 涡旋，一旦细菌培养达到足够的浊度（OD600 = 1），分解细胞团块。
4. 生物测定板的制备
注：生物测定板在层流罩中制备，以保持无菌。
- 使用 1.5% 琼脂制备 BHI 介质，并根据制造商说明通过高压灭菌进行灭菌。
- 高压灭菌后，在温控水浴中将BHI介质冷却至55°C。
- 使用血清学移液器，移液器 3 mL 的熔融 BHI 介质进入 12 个孔板上的 12 个孔中的每一口。确保井的精确性甚至均匀。一升介质可产生27个生物测定板。
- 让琼脂过夜。
5. 用测试生物机接种生物测定板
注：试验生物体是指使用共培养相互作用测定确定抑制活性（如抗生素生产）生产的有机体。在这个实验中，测试生物是从鼻腔样本中分离出的Actino细菌。
- 通过在生物测定板上插入无菌的10μL接种回路，在隔夜培养物中注入测试生物，并在板的左三分之一上划线培养物滴， 给测试生物体接种。
注：建议只连胜三分之一的井，因为油井的过度生长禁止以后接种目标生物体。 - 重复一遍，直到板上的所有12口井都接种了测试生物。
- 在适当的温度下倒置孵育板7天。在较高温度（+37°C）或较干燥的气候下，将板材存放在潮湿的容器中，以防止板材干燥。
6. 制备目标生物
注：目标生物体是指使用共培养相互作用测定确定其抑制状态的有机体。在本实验中，目标生物是从鼻腔样本中分离出的葡萄球菌。
- 孵育生物测定板6天后，如上文所述，制备指定目标生物体的过夜培养物（见第3节）。
7. 目标有机体接种
注：过夜孵育后，确保培养物浑浊（OD600 = 1）。一些细菌培养物可能在培养管底部絮凝。涡旋培养管以分散团块并评估文化浊度。
- 通过填充每口12孔板，填充1.8 mL的BHI和200μL的目标过夜培养，准备目标板。
- 解开，并将无菌接种戳放入目标板。轻轻地在井中旋转文化，注意确保文化不会交叉污染邻近的水井。
- 提起接种戳，并确保每个冲压盖上都有稀释的目标培养的滴。
-
通过将接种图章放在单卵生物测定板上，轻轻摇动印版，使每口孔的培养滴接种，准备单培养控制板。一旦去除了接种图章，生物测定板的井中应可以看到一滴培养。
- 如果由于介质水平不均匀，未用接种口接种任何水井，则使用移液器将稀释的过夜培养液的 3 μL 点到井的右侧。
- 如上所示，对生物测定板进行接种（参见步骤 7.4.1），但对齐戳，使吸孔与 12 孔板的右侧对齐。在接种油井时，确保戳记不会接触现有的细菌菌群。
- 小心地取下图章并放回目标板中。
- 对每个生物测定板重复接种，直到所有板都接种。
- 在适当的温度下将生物测试板倒置孵育7天。
8. 评分
-
共同培养测试和目标生物体 1 周后，根据以下视觉评估对相互作用进行评分：
- 用目标生物体生长，显示与单一培养控制无法区分的生长为"0"（无抑制）的井（图2A，B）。
- 与对照"1"（弱抑制）相比，目标有机体的生长下降（图2C）对井进行评分。
- 对目标生物体未长成"2"（强抑制）的井评分（图2D）。
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Representative Results
共培养相互作用测定可用于了解微生物相互作用，识别感兴趣的模式，并发现微生物分离物与有趣的活动。在这些测定中，测试生物体在12孔琼脂板的一侧进行单一培养，孵育7天。随后，在测试生物体旁边发现一个目标生物体，两种微生物共同培养7天，然后对目标生物体的生长表型进行评分。测定基于对目标生物体生长或抑制的可视化分析进行评分。
这些共培养物测定最近被用来评估活性球菌（测试生物）对从人类鼻腔分离的葡萄球菌（目标生物）的抑制活性（图2）16。共培养测定用于识别Actino细菌（n = 21）和葡萄球菌分离物（n = 39）之间的特定抑制模式，并表明Actino细菌分离物在抑制凝血酶阴性的能力方面表现出变化葡萄球菌（CoNS）。共测试了812个配对组合。特别是，丙酸杆菌强烈抑制CoNS（图2D），特别是与其他弱抑制CoNS（图2C）或对CoNS没有影响的其他Coryne细菌相比（图2B），与单一培养控制（图2A）16相比。
利用比较基因组学，在C.丙烯素基因组中鉴定出一种用于旁生菌生产的生物合成基因簇，该基因组在其他Corynebacum分离物的基因组中不存在。侧脊是微生物产生的包合剂，用于从环境中清除铁质17。经丙酮公司生产的侧磷被确认，侧磷被确定为脱水诺卡胺16。这一结果导致一种假设，即CoNS的抑制是由于侧泳介导的铁耗竭。随后，通过在标准基金和铁辅BHI介质上执行C.propinquum和CoNS之间的共培养物相互作用测定，确定抑制表型是铁依赖性的（图2E）。这些结果表明，旁磷介铁耗竭是C.propinquum16对CoNS的强烈抑制的原因。
图1：生物测定接种印章照片。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：共培养相互作用测定发现，通过丙基杆菌对CoNS的侧磷介导抑制。（A） 在BHI生物测定板上接种的CoNS（目标有机体）的单一培养。（B，C，D）不同菌株的Coryne细菌（测试生物，左）和在BHI生物测定板上接种的相同CoNS菌株（目标生物，右）之间的共培养。每个面板是一个代表性的图像，显示与 （B） 没有抑制 （分数 = 0）， （C） 弱抑制 （分数 = 1）， 或 （D） 强抑制 （分数 = 2） 的相互作用。（E） 在BHI介质（BHI）和BHI介质上与同一菌株的CoNS（副生产者）或丙烯杆菌（侧磷酸盐生产商）之间的相互作用比较辅以 200 μM FeCl3 （BHI + 铁）。请点击此处查看此图的较大版本。
补充数据文件。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
抗生素和其他介导微生物相互作用的次级代谢物可用于多种应用，包括药物发现。本文提出了一种用于评估大量微生物相互作用的共同培养测定方案。这些共培养相互作用测定是一种简单、经济、可扩展和高通量的方法，可同时研究许多微生物的成对组合。目标生物在12孔板的井中，使用接种标记在测试生物体旁边被发现，并且根据对目标生物体的表型的目视检查对目标生物体的抑制进行评分。这些检测中使用的大多数材料都可以通过大多数实验室供应商或通过公共资源随时获得。因此，检测可以很容易地针对许多实验室环境进行定制。在实验室中，这些共培养物测定已经成功地调查了与来自各种环境中的许多宿主相关的微生物的相互作用。
虽然此技术有许多优点，但也有一些限制。第一个值得注意的限制是，如果没有其他元数据，共同文化检测中的模式很难解释。在最近两篇采用这些共培养测定的文件中，只与其他元数据（如测试生物体的分类特征）一起识别了感兴趣的抑制模式。然而，即使没有附带的元数据，本文中概述的方法也可用于识别对特定病原体或感兴趣的微生物具有抑制活性的细菌分离物。
另一个限制是，这些检测不是商业上可用的，生物测定板必须手工准备，这可能会限制测定的效率。板材准备对实验至关重要，在准备板材时应小心谨慎。如果水井不均匀，则接种图章可能无法接种所有水井。然而，错过的井可以通过直接将目标生物体培养液移至每个接种井的右侧来接种。事实上，即使每块牌上都漏掉了几口井，这个程序也比直接将目标有机体移入每一口井更有效。或者，用户可以放弃接种戳，将目标生物体移入每个井中，但这个过程更耗时，特别是与同时冲压12口井相比。
最后，在接种目标生物体之前，测试生物体在单一培养期间可能消耗井中的可用营养。虽然营养消耗可能会影响观察到的抑制模式，但迄今为止已经测试的配对组合中似乎并不常见。值得注意的是，C.propinquum在油井中耗尽铁，使得人类鼻微生物群16号成员发现了由旁风素介导的竞争。
这些共培养相互作用的测定可以通过修改介质组成、时间，甚至包括多种生物体或微生物联合体作为测试生物来定制。此外，根据描述相互作用表型所需的详细程度，可以使用不同的评分系统。评分表示例包括用于描述从人类鼻腔16分离的细菌之间的竞争相互作用（图2）和0-3用于评估链球菌抗菌潜力的评分尺度从昆虫微生物群中分离出18。然而，随着更细微的尺度，得分变得越来越困难。因此，使用二进制评分系统（例如，0 定义为无抑制和 1 作为抑制）最容易识别抑制，这可以消除任何混淆并标准化多个个体的评分。此外，除了对抑制表型评分外，这些测定还可以针对其他表型进行评分，包括颜料生产、孢子或任何其他可以目视评估的表型。由于这些检测具有高度可扩展性，通过基于目标生物体的目视检查进行分析，因此可以生成机器学习算法的训练集，以促进表型评分并进一步提高测定吞吐量。
这些共性文化测定的一个主要优势是，它们能够促进以廉价和快速的方式筛选许多成对相互作用的组合，以发现感兴趣的活动或抑制模式。随后，可以使用更复杂的和强化的方法（即基因组表征、MALDI-TOF-IMS或天然产物分离和表征）来更深入地描述微生物和感兴趣的相互作用。共同文化测定。作为最近的一个例子，这些共培养抑制测定法用于表明昆虫衍生的链霉菌比土壤衍生的菌类更能抑制革兰氏阴性细菌和真菌。抑制测定使2，003链球菌分离物的抑制模式得以快速、高效地可视化，并发现了一种名为cyphomycin的新抗真菌药物，这种药物对耐药真菌病原体具有活性18.因此，这些共培养相互作用测定是微生物群研究、抗菌发现和深入了解微生物相互作用模式的有力工具。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的利益。
Acknowledgments
我们感谢丹尼尔·梅、马克·谢弗雷特和唐·黄对手稿的批判性阅读。这项工作，包括卡梅隆·柯里的努力，得到了威斯康星大学麦迪逊分校，研究和研究生教育副校长办公室的支持，由威斯康星校友研究基金会提供资金，资金也由国立卫生研究院转化研究卓越中心 （U19-AI109673-01）。Reed M. Stubbendieck 获得国家医学图书馆对生物和医学计算和信息学培训项目 （NLM 5T15LM007359） 的培训赠款的支持。资助者在研究设计、数据收集和解释方面没有作用，也没有提交作品以供出版的决定。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 μL disposable polystyrene inoculating loops, blue | VWR | 12000-806 | |
| 10 μL disposable polystyrene inoculating loops, yellow | VWR | 12000-810 | |
| 12-well cell culture plate, sterile with lid | Greiner bio-one | 665 180 | |
| 14 mL polystyrene round bottom tube, 17 x 100 mm 2style, nonpyrogenic, sterile | Falcon | 352057 | |
| 2.0 self standing screw cap tubes with caps, sterile | USA scientific | 1420-9710 | |
| 25 mL serological pipet | Cell Treat | 229225B | |
| Agar, bacteriological | VWR | J637 | |
| Brain Heart Infusion Broth | Dot Scientific | DSB11000-5000 | |
| Polycarbonate filament, white, 3 mm diameter | Keene Village Plastics | 12.1-3MM-WH-581.2-1KG-R | |
| School Glue | Elmer's | EPIE304 | |
| Taz 6 3D printer | Lulzbot |
References
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