Summary

רקמת הנדסה לשיקום שחזור הוושט בחולדות

Published: February 10, 2020
doi:

Summary

שחזור הוושט הוא הליך מאתגר, ופיתוח של הוושט רקמה מהונדסים המאפשרת התחדשות של רירית הוושט ואת השריר, כי ניתן להשתיל כמו שתל מלאכותי הוא הכרחי. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול שלנו כדי ליצור ושט מלאכותי, כולל ייצור פיגום, טיפוח ביוריאקטור, וטכניקות ניתוח שונות.

Abstract

השימוש בחומרים ביולוגיים לשיקום הוושט הוא משימה מאתגרת מבחינה טכנית בחולדות ודורשת טכניקת שתל אופטימלית עם תמיכה תזונתית. לאחרונה, היו ניסיונות רבים הנדסת רקמת הוושט, אבל שיעור ההצלחה הוגבלה בשל קושי הרקמות המוקדמות בסביבה מיוחדת של פריסטלזיס. כאן, פיתחנו ושט מלאכותי שיכול לשפר את התחדשות רירית הוושט ואת שכבות השריר דרך פיגום שני שכבתית, תא גזע mesenchymal מבוססי מערכת, וטכניקת האכלה מעקף עם שינוי . הכול בסדר הפיגום עשוי פוליאוריתן (PU) ננו סיבים בצורת גליל עם תלת מימדי (3D) מודפס גדיל polycalacטונוס עטוף סביב הקיר החיצוני. לפני ההשתלה, בתאי גזע של mesenchymal, שנגזרו על ידי בני אדם הפכו לתוך לומן הפיגום, והטיפוח הביולוגי בוצע כדי לשפר את הפעילות החוזרת התאית. שיפרנו את שיעור ההישרדות של השתל על ידי החלת השקה כירורגי וכיסוי תותבת מושתל עם דש בלוטת התריס, ואחריו האכלה זמנית שאינם אוראלי הזנה. שתלים אלה הצליחו ללכוד את הממצאים של האפיתל הראשונית התחדשות שרירים סביב האתרים מושתל, כפי שניתן להדגים על ידי ניתוח היסטולוגית. בנוסף, הגדילו את סיבי האלסטין ו ניאוואסקולריזציה נצפו בפריפריה של השתל. לכן, מודל זה מציג טכניקה חדשה פוטנציאלית לשיקום הוושט.

Introduction

הטיפול בהפרעות הוושט, כגון מומים מולדים וקרצינומות הוושט, יכול להוביל לאובדן קטע מבניים של הוושט. ברוב המקרים, שתלי החלפת אוטוולוגי, כגון תעלות משיכה בקיבה או המעי הגס, בוצעו1,2. עם זאת, אלה מחליפים הוושט יש מגוון של סיבוכים כירורגיים הפעלה מחדש סיכונים3. כך, השימוש ברקמות מהונדסים הוושט פיגומים קפלי מחקה את הוושט יליד יכול להיות אסטרטגיה חלופית מבטיח בסופו של דבר מתחדשות רקמות איבד4,5,6.

למרות הוושט מהונדסים רקמות פוטנציאלי מציע חלופה לטיפולים הנוכחיים של פגמים הוושט, יש מחסומים משמעותיים עבור שלה ביישום vivo. פוסט anastomotic דליפה ונמק של הגרדום הוושט מושתל בהכרח להוביל זיהום קטלני של מרחב אספטי שמסביב, כגון קרומי7. לכן, חשוב מאוד למנוע זיהום של מזון או רוק בפצע ושפופרת הקיבה. יש לשקול את הטיפול בחלזונות או בעירוי עד להשלמת ריפוי הפצע הראשוני. עד כה, הנדסת רקמת הוושט בוצעה במודלים בעלי חיים גדולים, כי בעלי חיים גדולים ניתן להאכיל רק על ידי ורידי hyperalimentation עבור 2-4 שבועות לאחר השרטת של הגרדום8. עם זאת, מודל כזה האכלה ללא אוראלי לא הוקמה להישרדות מוקדמת לאחר השתלת הוושט בבעלי חיים קטנים. זה בגלל החיות היו פעילים מאוד בלתי נשלט, כך הם לא יכלו לשמור את צינור האכלה בבטן שלהם למשך זמן ממושך. מסיבה זו, היו מקרים מעטים של השתלת הוושט מוצלחת בבעלי חיים קטנים.

לאור הנסיבות של הנדסת רקמת הוושט, עיצבנו בשני שכבות פיגום צינורי המורכב של אלקטרוסיבי ננו (השכבה הפנימית; איור 1א) ו-גדיל מודפס תלת-ממדי (שכבה חיצונית; איור 1ב) כולל טכניקת הגמניפולציה שהשתנתה. הננו סיבים פנימיים עשוי פו, פולימר לא תכלה, ומונע דליפת המזון והרוק. הגדילים החיצוניים תלת-ממדיים עשויים מסיבי פוליקטטון מתכלה (PCL), אשר יכולים לספק גמישות מכנית ולהסתגל לתנועה הפריסטלטית. בתאי גזע האדם הנגזרים משומן האנושי (היה-MSCs) הופרה על השכבה הפנימית של הפיגום כדי לקדם את האפיתל החדש. מבנה nanofiber יכול להקל על התחדשות המקורי רירית ידי מתן מטריצה מבניים (ecm) הסביבה להעברת תאים.

כמו כן הגבירו את שיעור ההישרדות ואת הפעילות הביואקטיביות של התאים שחוסנו באמצעות טיפוח ביוריאקטור שחקן. הגרדום המושתל היה מכוסה בכנף בלוטת התריס כדי לאפשר התחדשות יציבה יותר של רירית הוושט ושכבת השריר. בדוח זה, אנו מתארים פרוטוקולים עבור טכניקות הנדסת רקמת הוושט, כולל ייצור הפיגום, mesenchymal גזע תא מבוסס וטיפוח ביוריאקטור, טכניקת האכלה מעקף עם הגסטרו שונה, ו כירורגי שונה טכניקת ההשקה לשיקום שחזור הוושט במודל חולדה.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC No. 17-0164-S1A0) של האוניברסיטה הלאומית של סיאול בית החולים. 1. ייצור פיגום הערה: שני פיגומים על הוושט מיוצרים על ידי שילוב אלקטרורוטווד והדפסת תלת מימד. הקרום הפנימי של הפיגום הכרישים היה מפובר?…

Representative Results

איור 1 מציג תרשים סכמטי של תהליך הייצור של הפיגום הצינורי הדו-PCL שני שכבות. הפתרון PU היה אלקטרוסובב מ 18 גרם מחט לעשות מבנה פנימי גלילי עם עובי של 200 μm. לאחר מכן, PCL מומס הודפס על הקיר החיצוני של nanofiber PU במרווחי זמן קבועים. ניתן לראות את המבנה הפנימי של הקירות הפ…

Discussion

לימודי בעלי חיים קיימים בושט מלאכותי עדיין מוגבלים במספר גורמים קריטיים. לפיגום הוושט המלאכותי האידיאלי צריך להיות ביולוגי ולהיות בעל סגולות פיזיות מצוינות. זה אמור להיות מסוגל לחדש את האפיתל רירית בתקופה הפוסט מוקדם כדי למנוע דליפה anastomotic. התחדשות של שכבות המעגל הפנימי העגול החיצוני שר?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה היה נתמך על ידי קוריאה טכנולוגיה בריאות R & הפרויקט באמצעות המכון לפיתוח בריאות קוריאה (קהידי), ממומן על ידי משרד הבריאות & רווחה, הרפובליקה של קוריאה (מספר המענק: HI16C0362) ומחקר בסיסי המדע תוכנית באמצעות קרן המחקר הלאומי של קוריאה (NRF) ממומן על ידי משרד החינוך (2017R1C1B2011132). הביודגימות והנתונים המשמשים במחקר זה סופקו על ידי Biobank של האוניברסיטה הלאומית של סאול החולים, חבר של קוריאה Biobank רשת.

Materials

Metabolic cage TEUNGDO BIO & PLANT JD-C-66
Zoletil (50 mg/g dose) Virbac 1000000188
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
1 mL Syringe BD 309659
2% xylazine hydrochloride (Rumpun) Byely Q-0615-035
4% paraformaldehyde BIOSOLUTION BP031
4-0 Vicryl ETHICON W9443
9-0 Vicryl ETHICON W2813
Antibiotic gentamicin (Septopal). Septopal 0409-1207-03
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma 5470
Citrate Buffer, ph6.0, 10X Sigma C9999
DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT VECTOR SK4100
Desmin Santa Cruz sc-23879
Elastic stain kit ScyTeK ETS-1
Ethanol Merck 100983
Ethanol Merck 64-17-5
Fetal Bovine Serun (FBS) Gibco 16000-044
Glutaraldehyde Sigma 354400
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody ThermoFisher A-11001
Heparin cap Hyupsung Medical HS-T-05
hMSC (STEMPRO) / growth medium
(MesenPRO RSTM)
Invitrogen R7788-110
Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) VECTOR PK7800
Hydrogen peroxide JUNSEI 7722-84-1
Keratin13 Novus NBP1-97797
LIVE/DEAD Viability Assay Kit Molecular Probes L3224
Matrigel Corning 354262
N,N-dimethylformamide (DMF) Sigma 227056
Nonadherent
24-well tissue culture plates.
Corning 3738
OsO4 Sigma O5500
Petri dish Eppendorf 3072115
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 10010-023
Phosphate-buffered saline (PBS), 10X BIOSOLUTION BP007a
Polycaprolactone (PCL) polymer Sigma 440744
Polyurethane (PU+A2:A24) polymer Lubrizol 2363-80AE
Power Supply NanoNC HV100
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36931
Rumpun Bayer Q-0615-035
Silicone T-tube Sewoon Medical 2206-005
Terramycin Eye Ointment Pfizer Pharmaceutical Korea W01890011
Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) Virbac Laboratories Q-0042-058
Trichrome stain kit ScyTeK TRM-1
von Willebrand Factor (vWF) Santa Cruz sc 14014

Referências

  1. Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
  2. Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).
  3. Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).
  4. Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
  5. Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).
  6. La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).
  7. Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).
  8. Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).
  9. Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).
  10. Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. , (2019).
  11. Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
  12. Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).
  13. Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).
  14. Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).
  15. Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).
  16. Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).
check_url/pt/60349?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Kim, I. G., Wu, Y., Park, S. A., Cho, H., Shin, J., Chung, E. Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats. J. Vis. Exp. (156), e60349, doi:10.3791/60349 (2020).

View Video