Innesto ingegnerizzato per la ricostruzione esofagea circonferenza nei ratti
Summary
La ricostruzione esofagea è una procedura impegnativa e lo sviluppo di un esofago tissutale che consente la rigenerazione della mucosa e del muscolo esofageo e che può essere impiantato come un innesto artificiale. Qui, presentiamo il nostro protocollo per generare un esofago artificiale, tra cui la produzione di scaffold, la coltivazione di bioreattori e varie tecniche chirurgiche.
Abstract
L’uso di materiali biocompatibili per la ricostruzione esofagea circonferenziale è un compito tecnicamente impegnativo nei ratti e richiede una tecnica di impianto ottimale con supporto nutrizionale. Recentemente, ci sono stati molti tentativi di ingegneria dei tessuti esofagei, ma il tasso di successo è stato limitato a causa della difficoltà nell’epitelizzazione precoce nell’ambiente speciale della peristalsi. Qui, abbiamo sviluppato un esofago artificiale che può migliorare la rigenerazione della mucosa esofagea e degli strati muscolari attraverso uno scaffold tubolare a due strati, un sistema di bioreattore basato su cellule staminali mesenchymal, e una tecnica di alimentazione di bypass con modifica Gastrostomy. L’impalcatura è fatta di nanofibre di poliuretano (PU) in forma cilindrica con un filo policaprolactone stampato tridimensionale (3D) avvolto intorno alla parete esterna. Prima del trapianto, le cellule staminali mesenchimale derivate dall’uomo venivano seminata nel lume dell’impalcatura, e la coltivazione del bioreattore è stata eseguita per migliorare la reattività cellulare. Abbiamo migliorato il tasso di sopravvivenza dell’innesto applicando l’anastomosi chirurgica e coprendo la protesi impiantata con un lembo della ghiandola tiroidea, seguita da alimentazione temporanea della gastrostomia non orale. Questi innesti sono stati in grado di ricapitolare i risultati dell’epitelializzazione iniziale e della rigenerazione muscolare intorno ai siti impiantati, come dimostrato dall’analisi istologica. Inoltre, sono state osservate fibre di elastina aumentate e neovascolarizzazione nella periferia dell’innesto. Pertanto, questo modello presenta una nuova potenziale tecnica per la ricostruzione esofagea circonferenziale.
Introduction
Il trattamento dei disturbi esofagei, come malformazioni congenite e carcinomi esofagei, può portare alla perdita di segmento strutturale dell’esofago. Nella maggior parte dei casi, gli innesti di sostituzione autologia, come condotti gastrici pull-up o interposizioni del colon, sono stati eseguiti1,2. Tuttavia, queste sostituzioni esofagee hanno una varietà di complicazioni chirurgiche e rischi di rioperazione3. Così, l’uso di scaffold di esofago tessuto-ingegnerizzato imitando l’esofago nativo può essere una strategia alternativa promettente per rigenerare i tessuti persi4,5,6.
Anche se un esofago tessuto-ingegnerizzato potenzialmente offre un’alternativa agli attuali trattamenti di difetti esofagei, ci sono barriere significative per la sua applicazione in vivo. Perdite anastomotiche postoperatorie e necrosi dell’impalcatura esofagea impiantata portano inevitabilmente a un’infezione letale dello spazio asettico circostante, come il mediastinum7. Pertanto, è estremamente importante prevenire la contaminazione da cibo o saliva nella ferita e nel tubo nasogastrico. La gastrostomia o la nutrizione endovenosa devono essere considerati fino a quando la guarigione della ferita primaria è completata. Ad oggi, l’ingegneria dei tessuti esofagei è stata eseguita in grandi modelli animali perché i grandi animali possono essere alimentati solo da iperalimentativi per 2-4 settimane dopo l’impianto dell’impalcatura8. Tuttavia, tale modello di alimentazione non orale non è stato stabilito per la sopravvivenza precoce dopo il trapianto di esofageo in piccoli animali. Questo perché gli animali erano estremamente attivi e incontrollabili, quindi non potevano tenere il tubo di alimentazione nello stomaco per un lungo periodo di tempo. Per questo motivo, ci sono stati pochi casi di successo del trapianto esofageo in piccoli animali.
Tenuto conto delle circostanze dell’ingegneria esofagea del tessuto, abbiamo progettato uno scaffold tubolari a due strati costituito da nanofibre elettrospun (strato interno; Figura 1A) e un filo stampato in 3D (strato esterno; Figura 1B) compresa una tecnica di gastrostomia modificata. La nanofibra interna è fatta di PU, un polimero non degradabile, e previene la fuoriuscita di cibo e saliva. I fili stampati in 3D esterni sono fatti di policaprolactone (PCL) biodegradabile, in grado di fornire flessibilità meccanica e adattarsi al movimento peristale. Le cellule staminali mesenchymale di derivazione adiposa umana (hAD-MSC) sono state seminate sullo strato interno dello scaffold per promuovere la ri-epiterizzazione. La struttura in nanofibra può facilitare la rigenerazione iniziale delle mucosali fornendo un ambiente strutturale a matrice extracellulare (ECM) per la migrazione cellulare.
Abbiamo anche aumentato il tasso di sopravvivenza e la bioattività delle cellule inoculate attraverso la coltivazione di bioreattori. L’impalcatura impiantata è stata coperta con un lembo della ghiandola tiroidea per consentire una rigenerazione più stabile della mucosa esofagea e dello strato muscolare. In questa relazione, descriviamo protocolli per tecniche di ingegneria tissutale esofagea, tra cui la produzione di scaffold, la coltivazione di bioreattori basati sulle cellule staminali mesenchymale, una tecnica di alimentazione di bypass con gastrostomia modificata e una anastomosi per la ricostruzione esofagea circonferenziale in un modello di ratto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli studi esistenti sugli animali sull’esofago artificiale sono ancora limitati da diversi fattori critici. Lo scaffold esofageo artificiale ideale deve essere biocompatibile e avere eccellenti proprietà fisiche. Dovrebbe essere in grado di rigenerare l’epitelio mucosale nel primo periodo postoperatorio per prevenire perdite anastomiche. La rigenerazione degli strati muscolari longitudinali circolari ed esterni è importante anche per la peristalsi funzionale12,13</su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dal Progetto di R&S della tecnologia sanitaria coreana attraverso il Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziato dal Ministero della Salute & Welfare, dalla Repubblica di Corea (numero di sovvenzione: HI16C0362) e dalla Ricerca Scientifica di base Programma attraverso la National Research Foundation of Korea (NRF) finanziato dal Ministero dell’Istruzione (2017R1C1B2011132). Le biocampioni e i dati utilizzati in questo studio sono stati forniti dalla Biobank dell’Ospedale Nazionale dell’Università di Seoul, membro della Korea Biobank Network.
Materials
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
Referências
- Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
- Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).
- Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).
- Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
- Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).
- La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).
- Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).
- Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).
- Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).
- Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. , (2019).
- Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
- Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).
- Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).
- Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).
- Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).
