Sıçanlarda Çevresel Özofagus Rekonstrüksiyonu için Doku-Mühendislik Greft
Summary
Özofagus rekonstrüksiyonu zorlu bir işlemdir ve özofagus mukozası ve kasının yenilenmesini sağlayan ve yapay greft olarak implante edilebilen doku mühendisliğiöz bir özofagusun geliştirilmesi gereklidir. Burada, iskele imalatı, biyoreaktör ekimi ve çeşitli cerrahi teknikler de dahil olmak üzere yapay bir özofagus oluşturmak için protokolümüzü saklı yız.
Abstract
Çevresel özofagus rekonstrüksiyonu için biyouyumlu malzemelerin kullanılması sıçanlarda teknik olarak zorlu bir görevdir ve beslenme desteği ile optimal bir implant tekniği gerektirir. Son zamanlarda, özofagus doku mühendisliği birçok girişimleri olmuştur, ancak peristalsis özel ortamda erken epitelizasyon zorluk nedeniyle başarı oranı sınırlı olmuştur. Burada, iki katmanlı tübüler iskele, mezenkimal kök hücre tabanlı biyoreaktör sistemi ve modifiye edilmiş baypas besleme tekniği ile özofagus mukozası ve kas tabakalarının yenilenmesini iyileştirebilen yapay bir özofagus geliştirdik. gastrostomi. İskele poliüretan yapılır (PU) üç boyutlu (3D) baskılı polikaprolakon iplikçik dış duvara sarılmış silindirik bir şekil nanofibers. Transplantasyondan önce, insan kaynaklı mezenkimal kök hücreler iskelenin lümenine tohumlanmış ve hücresel reaktiviteyi artırmak için biyoreaktör ekimi yapılmıştır. Cerrahi anastomoz uygulayarak ve implante edilen protezi tiroid bezi flebi ile kaplayarak greft sağkalım oranını artırdık ve ardından geçici oral olmayan gastrostomi beslenmesi yaptık. Bu greftler histolojik analizde gösterildiği gibi implante edilen bölgelerin çevresinde ilk epitelizasyon ve kas rejenerasyonu bulgularını tekrar ortaya çıkarabildiler. Buna ek olarak, greft çevresinde artmış elastin lifleri ve nevasaskülarizasyon gözlendi. Bu nedenle, bu model çevresel özofagus rekonstrüksiyonu için potansiyel yeni bir teknik sunar.
Introduction
Konjenital malformasyonlar ve özofagus karsinomları gibi özofagus bozukluklarının tedavisi özofagusun yapısal segment kaybına yol açabilir. Çoğu durumda, gastrik pull-up kanalları veya kolon interpozisyonları gibi otolog replasman greftleri1,2yapılmıştır. Ancak bu özofagus replasmanlarının çeşitli cerrahi komplikasyonları ve reoperasyon risklerivardır 3. Böylece, doku mühendislik özofagus iskeleleri yerli özofagus taklit kullanımı sonuçta kayıp dokuların yenilenmesi için umut verici bir alternatif strateji olabilir4,5,6.
Doku ile tasarlanmış bir özofagus, özofagus defektlerinin mevcut tedavilerine potansiyel olarak bir alternatif sunsa da, in vivo uygulaması için önemli engeller vardır. Postoperatif anastomoz kaçağı ve implante özofagus iskelesi nekroz kaçınılmaz mediasten 7 gibi çevreleyen aseptik alan, ölümcül bir enfeksiyona yol . Bu nedenle yara ve nazogastrik tüpte gıda veya tükürük kontaminasyonunu önlemek son derece önemlidir. Primer yara iyileşmesi tamamlanana kadar gastrostomi veya intravenöz beslenme düşünülmelidir. Büyük hayvanlar iskele8implantasyonundan sonra 2-4 hafta boyunca sadece intravenöz hiperalimentasyon ile beslenebilir, çünkü bugüne kadar, özofagus doku mühendisliği büyük hayvan modellerinde yapılmıştır . Ancak küçük hayvanlarda özofagus nakli sonrası erken sağkalım için böyle bir oral olmayan beslenme modeli oluşturulmamıştır. Bunun nedeni hayvanların son derece aktif ve kontrol edilemeyen olmalarıdır, bu yüzden beslenme tüpünü uzun süre midelerinde tutamamışlardır. Bu nedenle küçük hayvanlarda az sayıda özofagus nakli vakası olmuştur.
Özofagus doku mühendisliği koşulları göz önüne alındığında, elektrospun nanofibers (iç tabaka; Şekil 1A) ve 3B baskılı iplikçik (dış tabaka; Şekil 1B) modifiye gastrostomi tekniği ni de içeren. Dahili nanofiber PU yapılır, bir un-gradable polimer, ve gıda ve tükürük sızıntısı nı önler. Dış 3D baskılı iplikçikler biyobozunur polikaprolakondan yapılmıştır (PCL), mekanik esneklik sağlayabilir ve peristaltik harekete uyum. İnsan yağtüretilmiş mezenkimal kök hücreler (hAD-MSCs) yeniden epitelizasyonu teşvik etmek için iskelenin iç tabakasında tohumlandı. Nanofiber yapısı hücre göçü için yapısal bir hücre dışı matriks (ECM) ortamı sağlayarak ilk mukozal rejenerasyonu kolaylaştırabilir.
Ayrıca biyoreaktör ekimi yoluyla aşılanmış hücrelerin sağkalım oranını ve biyoaktivitesini artırdık. İmplante edilen iskele, özofagus mukozası ve kas tabakasının daha istikrarlı bir şekilde yenilenmesini sağlamak için tiroid bezi flebi ile kaplandı. Bu raporda, iskele imalatı, mezenkimal kök hücre bazlı biyoreaktör ekimi, modifiye gastrostomi ile baypas besleme tekniği ve modifiye cerrahi dahil olmak üzere özofagus doku mühendisliği teknikleri için protokoller açıklanmaktadır. bir sıçan modelinde çevresel özofagus rekonstrüksiyonu için anastomoz tekniği.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yapay özofaji üzerinde mevcut hayvan çalışmaları hala çeşitli kritik faktörler ile sınırlıdır. İdeal yapay özofagus iskelesi biyouyumlu olmalı ve mükemmel fiziksel özelliklere sahip olmalıdır. Anastomoz sızıntısını önlemek için erken postoperatif dönemde mukozal epiteli yenileyebilmeli. İç dairesel ve dış boylamsal kas tabakalarının yenilenmesi de fonksiyonel peristalsis için önemlidir12,13.
Yemek bo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Kore Sağlık Endüstrisi Geliştirme Enstitüsü (KHIDI) aracılığıyla Kore Sağlık Teknolojisi Ar-Ge Projesi tarafından desteklenmiştir, Sağlık ve Refah Bakanlığı tarafından finanse edilen, Kore Cumhuriyeti (hibe numarası: HI16C0362) ve Temel Bilim Araştırma Eğitim Bakanlığı tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) programı (2017R1C1B2011132). Bu çalışmada kullanılan biyoörnekler ve veriler Kore Biobank Network üyesi Olan Seul Ulusal Üniversitesi Hastanesi Biyobankası tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
Referências
- Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
- Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).
- Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).
- Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
- Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).
- La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).
- Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).
- Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).
- Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).
- Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. , (2019).
- Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
- Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).
- Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).
- Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).
- Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).
