ラットにおける円周食道再建のための組織工学型移植片
Summary
食道再建は困難な処置であり、食道粘膜や筋肉の再生を可能にし、人工移植として移植できる組織工学的食道の開発が必要である。ここでは、足場製造、バイオリアクター栽培、各種外科技術など、人工食道を生成するためのプロトコルを紹介します。
Abstract
周食道再建のための生体適合性材料の使用は、ラットでは技術的に困難な作業であり、栄養サポートを備えた最適なインプラント技術が必要です。最近、食道組織工学の試みが多く行われているが、蠕動の特殊環境における早期上皮化の困難により成功率が制限されている。ここでは、2層管状足場、間葉系幹細胞ベースのバイオリアクターシステム、変性を有するバイパス給餌技術を通じて食道粘膜および筋肉層の再生を改善できる人工食道を開発しました。胃腸炎。足場は、外壁に巻かれた3次元(3D)印刷ポリカプロラクタンストランドを有する円筒形のポリウレタン(PU)ナノファイバーで作られています。移植前に、ヒト由来間葉系幹細胞を足場の内腔に播種し、細胞反応性を高めるバイオリアクター栽培を行った。手術用吻合を適用し、移植された補綴物を甲状腺フラップで覆い、続いて一時的な非経口胃切り出しを行うことで、移植片の生存率を改善した。これらの移植片は、組織学的分析によって示されるように、移植された部位の周りの最初の上皮化および筋肉再生の知見を要約することができた。また、移植片の周辺部ではエラスチン繊維の増加および新血管形成が認められた。したがって、このモデルは、周食道再建のための潜在的な新しい技術を提示する。
Introduction
先天性奇形や食道癌などの食道障害の治療は、食道の構造セグメント喪失につながる可能性があります。ほとんどの場合、胃プルアップ導管や結腸の入管などの自家置換移植片は、1,2を行なわれている。しかし、これらの食道置換は、様々な外科的合併症および再操作リスク3を有する。したがって、天然食道を模倣した組織工学的食道足場の使用は、最終的に失われた組織4、5、6を再生するための有望な代替戦略となり得る。
組織工学的食道は、食道欠損の現在の治療法に代わる可能性がありますが、生体内での適用には重大な障壁があります。移植された食道足場の術後の解剖学的漏出および壊死は、必然的に、網介素7のような周囲の無菌空間の致死的な感染につながる。したがって、創傷および胃チューブにおける食物または唾液汚染を防止することが極めて重要である。胃の治療または静脈内栄養は、原発性創傷治癒が完了するまで考慮されるべきである。これまで、大動物は足場8の注入後2〜4週間静脈内過敏によってのみ送ることができるので、食道組織工学は大型動物モデルで行われてきた。しかし、このような非経口摂食モデルは、小動物における食道移植後の早期生存のために確立されていない。これは、動物が非常に活発で制御不能であったため、長時間胃の中に給餌管を入れておくことができなかったためです。このため、小動物の食道移植に成功した症例は少なかった。
食道組織工学の状況を考慮して、エレクトロスパンナノファイバー(内層;)図1A)と3Dプリントされたストランド(外側の層;図1B)は、変性胃管選択術を含む。内部ナノファイバーは、非分解性ポリマーであるPUで作られており、食品や唾液の漏洩を防ぎます。外部の3Dプリントストランドは、機械的柔軟性を提供し、蠕動態に適応することができる生分解性ポリカプロラクテン(PCL)で作られています。ヒト脂肪由来間葉系幹細胞(hAD-MSCs)を足場の内層に播種し、再上皮化を促進した。ナノファイバー構造は、細胞移動のための構造細胞外マトリックス(ECM)環境を提供することによって初期粘膜再生を容易にすることができる。
また、バイオリアクター栽培を通じて、接種細胞の生存率と生物活性を向上させてきた。埋め込まれた足場は、食道粘膜および筋肉層のより安定した再生を可能にするために甲状腺フラップで覆われていた。このレポートでは、足場製造、間葉系幹細胞ベースのバイオリアクター栽培、変性胃細胞切除術を伴うバイパス給餌技術、改変手術などの食道組織工学技術のプロトコルについて説明します。ラットモデルにおける周食道再建のための吻合法
Protocol
Representative Results
Discussion
人工食道に関する既存の動物研究は、依然としていくつかの重要な要因によって制限されています。理想的な人工食道足場は、生体適合性を持ち、優れた物理的特性を有する必要があります。手術後の初期の期間に粘膜上皮を再生して、解剖学的漏れを防ぐことができるはずです。内側の円形および外側縦方向の筋肉層の再生は、機能的蠕動12、13?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、韓国保健産業開発研究所(KHIDI)を通じて韓国保健技術研究開発プロジェクトを支援し、厚生省(助成番号:HI16C0362)と基礎科学研究文部省が資金を提供する国立韓国研究財団(NRF)を通じたプログラム(2017R1C1B2011132)。本研究で使用された生物標本とデータは、韓国バイオバンクネットワークのメンバーであるソウル国立大学病院のバイオバンクによって提供されました。
Materials
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
Referências
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