Enxerto projetado por tecido para reconstrução circunferencial do Esôfago em Ratos
Summary
A reconstrução do esôfago é um procedimento desafiador, e o desenvolvimento de um esôfago projetado por tecido que permite a regeneração da mucosa esofágica e muscular e que pode ser implantado à medida que um enxerto artificial é necessário. Aqui, apresentamos nosso protocolo para gerar um esôfago artificial, incluindo fabricação de andaimes, cultivo de bioreatores e várias técnicas cirúrgicas.
Abstract
O uso de materiais biocompatíveis para reconstrução circunferencial do esôfago é uma tarefa tecnicamente desafiadora em ratos e requer uma técnica ideal de implante com suporte nutricional. Recentemente, houve muitas tentativas de engenharia de tecidos esofágicos, mas a taxa de sucesso foi limitada devido à dificuldade na epitação precoce no ambiente especial da peristalse. Aqui, desenvolvemos um esôfago artificial que pode melhorar a regeneração da mucosa esofágica e camadas musculares através de um andaime tubular de duas camadas, um sistema de bioreator à base de células-tronco mesenquiérmicos e uma técnica de alimentação de bypass com modificação Gastrostomia. O andaime é feito de nanofibras de poliuretano (PU) em uma forma cilíndrica com um fio de policaprolactona impresso tridimensional (3D) enrolado ao redor da parede externa. Antes do transplante, as células-tronco mesenquimals derivadas pelo homem foram semeadas no lúmen do andaime, e o cultivo de bioreator foi realizado para melhorar a reatividade celular. Melhoramos a taxa de sobrevivência do enxerto aplicando anastomose cirúrgica e cobrindo a prótese implantada com um retalho da glândula tireoide, seguido de alimentação temporária de gastrostomia não oral. Esses enxertos foram capazes de recapitular os achados da epitelialização inicial e regeneração muscular em torno dos locais implantados, como demonstrado pela análise histológica. Além disso, foram observadas fibras de elastina aumentadas e neovascularização na periferia do enxerto. Portanto, este modelo apresenta uma potencial nova técnica para a reconstrução circunferencial do esôfago.
Introduction
O tratamento de distúrbios esofágicos, como malformações congênitas e carcinomas esofágicos, pode levar à perda estrutural do segmento do esôfago. Na maioria dos casos, enxertos de substituição autólogas, como conduítes gástricos ou interposições de cólon, foram realizados1,2. No entanto, essas substituições de esôfago têm uma variedade de complicações cirúrgicas e riscos de reoperação3. Assim, o uso de andaimes de esôfago projetados por tecido imitando o esôfago nativo pode ser uma estratégia alternativa promissora para, em última análise, regenerar tecidos perdidos4,5,6.
Embora um esôfago projetado por tecido potencialmente ofereça uma alternativa aos tratamentos atuais de defeitos esofágicos, existem barreiras significativas para sua aplicação in vivo. Vazamento anastomótico pós-operatório e necrose do andaime esôfago implantado inevitavelmente levam a uma infecção letal do espaço asséptico circundante, como o mediastinum7. Por isso, é extremamente importante prevenir a contaminação de alimentos ou saliva na ferida e na sonda nasogástrica. Gastrostomia ou nutrição intravenosa devem ser consideradas até que a cicatrização da ferida primária seja concluída. Até o momento, a engenharia de tecidos esofágicos tem sido realizada em grandes modelos animais porque animais de grande porte só podem ser alimentados por hiperalimentação intravenosa por 2-4 semanas após a implantação do andaime8. No entanto, tal modelo de alimentação não oral não foi estabelecido para a sobrevivência precoce após o transplante de esôfago em animais pequenos. Isso porque os animais eram extremamente ativos e incontroláveis, então eles não podiam manter o tubo de alimentação em seus estômagos por um longo período de tempo. Por essa razão, houve poucos casos de transplante esofágico bem sucedido em animais pequenos.
Em vista das circunstâncias da engenharia de tecidos esofágicos, projetamos um andaime tubular de duas camadas composto por nanofibras eletrospun (camada interna; Figura 1A) e um fio impresso em 3D (camada externa; Figura 1B) incluindo uma técnica modificada de gastrostomia. A nanofibra interna é feita de PU, um polímero não degradável, e previne o vazamento de alimentos e saliva. Os fios impressos 3D externos são feitos de policaprolactona biodegradável (PCL), que pode fornecer flexibilidade mecânica e se adaptar ao movimento peristaltico. Células-tronco mesenquimicas derivadas de adiposas humanas (hAD-MSCs) foram semeadas na camada interna do andaime para promover a reepitada. A estrutura da nanofibra pode facilitar a regeneração mucosa inicial, fornecendo um ambiente estrutural de matriz extracelular (ECM) para migração celular.
Também aumentamos a taxa de sobrevivência e a bioatividade das células inoculadas através do cultivo de bioreatores. O andaime implantado foi coberto com uma aba de glândula tireoide para permitir uma regeneração mais estável da mucosa esofágica e da camada muscular. Neste relatório, descrevemos protocolos para técnicas de engenharia de tecidos esofágicos, incluindo fabricação de andaimes, cultivo de bioreator à base de células-tronco mesenquimicas, uma técnica de alimentação de bypass com gastrostomia modificada e uma cirurgia modificada técnica de anastomose para reconstrução circunferencial do esôfago em um modelo de rato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os estudos em animais existentes sobre esôfagos artificiais ainda são limitados por vários fatores críticos. O andaime artificial ideal deve ser biocompatível e ter excelentes propriedades físicas. Ele deve ser capaz de regenerar o epitélio mucosa no início do pós-operatório para evitar vazamento saofótico. A regeneração das camadas musculares circulares internas e longitudinal externas também é importante para a peristalse funcional12,13.
<p c…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo Korea Health Technology P&D Project, por meio do Instituto de Desenvolvimento da Indústria da Saúde da Coreia (KHIDI), financiado pelo Ministério da Saúde & Bem-Estar, República da Coreia (número de subvenção: HI16C0362) e Pesquisa Científica Básica Programa por meio da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da Educação (2017R1C1B2011132). Os bioespécimes e dados utilizados neste estudo foram fornecidos pelo Biobank of Seul National University Hospital, membro da Korea Biobank Network.
Materials
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
Referências
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