Summary
Blæremola føflekker er unormale menneskelige svangerskap med heterogene etiologi som kan klassifiseres i henhold til deres morfologiske funksjoner og foreldrenes bidrag til molar genomer. Her er protokoller av multiplex mikrosatellittmarkør DNA genotyperingteknologi og flyt flowcytometri av formalin-fast parafin-embedded molar vev beskrevet i detalj, sammen med resultatene ' tolkning og integrering.
Abstract
Blæremola Mole (HM) er en unormal menneskelig graviditet preget av overdreven trofoblastiske spredning og unormal embryoutvikling. Det er to typer HM basert på en mikroskopisk morfologiske evaluering, komplett HM (CHM) og delvis HM (PHM). Disse kan videre deles basert på foreldrenes bidrag til molar genomer. Slik karakterisering av HM, ved morfologi og genotype analyser, er avgjørende for pasientbehandling og for den grunnleggende forståelsen av denne spennende patologi. Det er godt dokumentert at morfologiske analyse av HM er underlagt bred interobserver variasjon og er ikke tilstrekkelig på egen hånd for å nøyaktig klassifisere HM i CHM og PHM og skille dem fra hydropic ikke-molar aborter. Genotyperingteknologi analyse er hovedsakelig utført på DNA og vev fra formalin-fast parafin-embedded (FFPE) produkter av unnfangelsen, som har mindre enn optimal kvalitet og kan følgelig føre til feil konklusjoner. I denne artikkelen, detaljerte protokoller for multiplex genotyperingteknologi og flyt flowcytometri analyser av FFPE molar vev er gitt, sammen med tolkningen av resultatene av disse metodene, deres feilsøking, og integrasjon med morfologiske evaluering , P57KIP2 immunhistokjemi og fluorescens in situ HYBRIDISERING (Fish) for å nå en korrekt og robust diagnose. Her forfatterne dele metoder og erfaringer i de siste 10 årene fra analysen av ca 400 produkter av unnfangelsen.
Introduction
En blæremola muldvarp (HM) er en unormal menneskelig graviditet preget av unormal embryoutvikling, hyperproliferation av trophoblast, og hydropic degenerasjon av humant Villi (CV). Historisk sett brukte HM å deles inn i to typer, komplett HM (CHM) og delvis HM (PHM) basert bare på morfologiske evaluering1. Det har imidlertid vist seg at morfologiske evaluering alene ikke er tilstrekkelig til å klassifisere hm i de to under typer (chm og PHM) og skille dem fra ikke-molar aborter2,3,4.
Fordi CHM og PHM har forskjellige propensities til ondartet, er det derfor viktig å nøyaktig bestemme den genotypisk typen HM for å gi riktig oppfølging og behandling til pasientene. Følgelig, i de siste ti årene, flere metoder har blitt utviklet og utviklet for det formål å identifisere foreldrenes bidrag til molar vev og nå en riktig klassifisering av HM. Disse inkluderer Karyotype analyse, kromosom striper polymorfisme, Human leukocytter antigen (HLA) serologisk skrive, begrensning fragment lengde polymorfisme, variabel antall tandem gjentar, mikrosatellittmarkør genotyperingteknologi, flyt flowcytometri, og P57 KIP2 immunhistokjemi. Dette har tillatt nøyaktig oppdeling av HM konsepsjoner basert på foreldrenes bidrag til deres genomer, som følger: CHM, som er diploid androgenetic monospermic eller diploid androgenetic dispermic, og PHM, som er triploid, dispermic i 99% og monospermic i 1% av tilfellene5,6,7,8. Videre er det en annen genotypisk type HM som oppsto i de siste to ti årene, som er diploid biparental. Sistnevnte er mest tilbakevendende og kan påvirke et enkelt familiemedlem (simplex tilfeller) eller minst to familiemedlemmer (familiær saker). Disse diploid biparental føflekker er hovedsakelig forårsaket av resessivt mutasjoner i NLRP7 eller KHDC3L i pasienter9,10,11,12. Diploid biparental hm hos pasienter med resessivt mutasjoner i NLRP7 kan diagnostiseres som chm eller PHM av morfologiske analyse og dette synes å være assosiert med alvorlighetsgraden av mutasjoner i pasientene13,14. I tillegg til klassifisering av HM i henhold til deres genotyper, innføring og bruk av flere genotyperingteknologi metoder tillot skillet mellom de ulike molar enheter fra ikke-molar aborter, slik som aneuploid diploid biparental konsepsjoner og andre typer konsepsjoner5,15. Slike forestillinger kan ha noen trophoblast spredning og unormal villous morfologi som etterligner, til en viss grad, noen morfologiske funksjoner av HM.
Hensikten med denne artikkelen er å gi detaljerte protokoller for multiplex genotyperingteknologi og flyt flowcytometri av formalin-fast parafin-embedded (FFPE) vev, og omfattende analyser av resultatene av disse metodene og deres integrasjon med andre metoder for korrekt og avgjørende diagnose av molar vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøkelsen ble godkjent av McGill institusjonelle Review Board. Alle pasienter gitt skriftlig samtykke til å delta i studien og å ha sine FFPE produkter av unnfangelsen (Pocer) Hentet fra ulike patologi avdelinger.
Merk: Mens det finnes flere metoder for genotyperingteknologi og ploidy bestemmelse ved flyt flowcytometri, protokollene gitt her beskriver en metode for analyse ved hjelp av én plattform for hver.
1. genotyperingteknologi
-
Valg av den beste FFPE-blokken
- For hver FFPE produkt av unnfangelse (POC), forberede 4 μm-tykke hematoksylin og eosin (H & E) fargede seksjoner som beskrevet i avsnittene 1,2 og 1,3, en for hver tilgjengelig blokk, for morfologiske evaluering av mikroskopi.
- Ved hjelp av H & E-lysbildene og et lys mikroskop, velger du FFPE-blokken som har den største mengden av Villi (CV), og hvis mulig, blokken som har CV atskilt fra, og ikke blandet med, mors vev.
-
Snitting
- Plasser den valgte blokken på isen i 15 minutter for å lette snitting.
- Juster mikrotomen for å kutte deler som er 4 μm tykke for mikroskopisk morfologiske evaluering og 10 μm tykk for DNA-ekstraksjon.
- Plasser den kalde blokken i mikrotomen og klipp ut en seksjon fra hver blokk for H & E farging og 10 − 30 seksjoner fra den valgte blokken, avhengig av mengden av CV i blokken, for DNA-ekstraksjon.
Merk: For blokker som er fulle av CV, er 10 seksjoner tilstrekkelige for DNA-ekstraksjon. Hvis bare ca 10% av blokken inneholder CV mens resten er mors vev, så 20 − 30 seksjoner er nødvendig for å sikre tilstrekkelige mengder DNA. - Bruke tang, overføre hver seksjon til en 45 ° c vannbad. Plukk opp seksjonen fra vannbadet med et positivt ladet lysbilde (tabell over materialer) som tidligere er merket med eksempel identifikasjonsnummeret ved hjelp av en blyant.
- Plasser lysbildene som inneholder seksjonene i en ovn ved 65 ° c, slik at delene kan festes til lysbildene. Hold lysbildene for H & E i ovnen i 25 min. Hold lysbildene for DNA-ekstraksjon i ovnen i 20 min.
Merk: Den kortere inkubasjonstiden gjør vev litt mindre tilhenger til lysbildene og dermed Letter fjerningen av mors vev.
-
H & E flekker
- La lysbildene avkjøles til romtemperatur (10 min).
- Forberedelse av reagenser
- Forbered Eosin Y arbeids løsning (0,25% som per tabell 1. Bland godt og oppbevar ved romtemperatur.
- Forbered arbeids hematoksylin løsning ved fortynning av lagerløsning av hematoksylin 5x i vann (dvs. Bland 80 mL vann med 20 mL hematoksylin).
Merk: Wrap lagerløsning av hematoksylin i folie for lagring.
- Klargjør farge glassene med riktige reagenser under en avtrekks hette i henhold til tabell 2.
- Utfør H & E farging ved å submerging lysbildene i de riktige farge glassene for riktig tidsperiode i henhold til tabell 2.
- Monter de 4 μm seksjoner for morfologiske analyse med festemiddel og dekkglass med glass coverslips (tabell av materialer).
Merk: Delene på 10 μm for genotyperingteknologi skal ikke påsatt dekkglass. - La de 10 μm delene under røyk panseret i minst 3 t for at det giftige xylen lukter skal forsvinne.
Forsiktig: Alle flekker trinnene må utføres under en avtrekksvifte. Xylen produkter må holdes under panseret til enhver tid fordi xylen lukter er giftige. Videre må xylen og hematoksylin kasseres i spesielle beholdere. Når disse beholderne er fulle, de må kastes som anbefalt av laboratoriet sikkerhet organisasjon.
| Reagens | Antall |
| Eosin Y lagerløsning (1%) | 250 mL |
| 80% etanol | 750 mL |
| Bre eddiksyre (konsentrert) | 5 mL |
Tabell 1: Eosin Y arbeids løsning (0,25%) Forberedelse.
| Reagens som brukes (100 mL per skuff) | Varighet |
| 1) xylen | 5 min |
| 2) xylen | 5 min |
| 3) 100% etanol | 2 min |
| 4) 95% etanol | 2 min |
| 5) 70% etanol | 2 min |
| 6) 50% etanol | 2 min |
| 7) destillert vann | 5 min |
| 8) hematoksylin | 4 min |
| 9) destillert vann | 5 min |
| 10) Eosin | 1 min |
| 11) 95% etanol | 5 min |
| 12) 100% etanol | 5 min |
| 13) xylen | 5 min |
| 14) xylen | 5 min |
Tabell 2: reagenser og varigheter for farge protokollen H & E.
-
Isolering av CV
- Under en lett stereomikroskopet, bruk pinsett og små biter av vann fuktet papirkluter (tabell av materialer) for å skrape av uønsket mors vev fra H & E-beiset 10 μm tykke seksjoner.
Merk: Målet er å holde noe annet enn CV eller Foster membraner (når de finnes) på lysbildene og dermed fjerne alle andre vev. Dette trinnet kan trenge mye tid og tålmodighet, avhengig av blokken, som det krever grundige hensyn til detaljer. - Har en annen person dobbelt-sjekk lysbildene etter rengjøring for å sikre at de er fri for mors vev.
- Ta bilder av de rene lysbildene eller dokumentere følgende for å hjelpe til med data tolkning: 1) om vevet var vanskelig å rengjøre, hemoragisk, eller veldig rent, 2) antall seksjoner som brukes, og 3) omtrentlig mengde renset vev.
Merk: figur 1 gir et eksempel på et lysbilde som er enkelt å rengjøre. For en blokk som inneholder omtrent denne mengden av CV, er 10 seksjoner tilstrekkelig for DNA-ekstraksjon. Raset i figur 2 har svært få CV som er blandet med mors vev, noe som gjør det svært vanskelig og tidkrevende å rengjøre. For en blokk som inneholder omtrent denne mengden av CV, er 30 seksjoner nødvendig for DNA-ekstraksjon. - Samle CVEN ved hjelp av små, fuktet papirkluter. Bruk tang, rive en liten brikke ut av fuktet papirkluter og bruke den til å samle CV.
- Legg bitene av papirkluter med tilhørende CV inn i et merket 1,5 mL rør.
- Minimer mengden papirkluter som brukes i dette trinnet som for mye kan tette DNA-ekstraksjon kolonnen og dermed redusere den endelige mengden av innsamlet DNA. I gjennomsnitt, tar sikte på å bruke mindre enn syv små biter av papirkluter per prøve. Hvis det ikke er mulig på grunn av tilstedeværelsen av store mengder CV, dele prøven blant to rør for å lette utvinning.
- Under en lett stereomikroskopet, bruk pinsett og små biter av vann fuktet papirkluter (tabell av materialer) for å skrape av uønsket mors vev fra H & E-beiset 10 μm tykke seksjoner.
Figur 1: representativt lysbilde for genotyperingteknologi. Topp: et lysbilde som må "rengjøres" for å bli fri for mors vev. Nederst: det samme lysbildet som vises etter at det har blitt rengjort og inneholder nå bare CV for DNA-ekstraksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representativt lysbilde for genotyperingteknologi. Topp: et lysbilde som må "rengjøres" for å bli fri for mors vev. Nederst: det samme lysbildet som vises etter at det har blitt rengjort og inneholder nå bare CV for DNA-ekstraksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Følg protokollen av DNA-ekstraksjon fra FFPE Kit (tabell av materialer) for å utføre DNA-ekstraksjon.
Merk: Noen sett anbefaler å bruke 15 − 20 μL av eluering buffer for den endelige eluering. Av erfaring fungerer eluering med 15 μL av eluering buffer godt for de fleste prøvene. Fortynninger kan fremstilles fra lager DNA etter behov.
-
DNA-kvantifisering
- Ved bruk av en laboratorie spektrofotometer innretning, Last 1 μL av DNA og mål absorbansen ved 260 NM for kvantifisering.
- Legg 1 μL av DNA på en 2% agarose gel og Kjør gel-elektroforese med en spenning på 80 − 100 V for kvalitativ evaluering.
- Basert på resultatene av trinnene 1.6.1 og 1.6.2, velge volumet av DNA som skal brukes i multiplex kort tandem gjenta (STR) polymerase kjedere reaksjon (PCR) forsterkning. Sikte på å bruke minimum 1000 ng av DNA i PCR forsterkning som følger.
Merk: Figur 3 demonstrerer representative eksempler på gels sammen med konsentrasjonen av DNA (basert på spektrofotometer Results), og volumet av DNA-løsningen som er anbefalt for multiplex str PCR som følger.
Figur 3: representativ gel for DNA-kvantifisering. Inkludert er konsentrasjonen av hvert DNA, målt ved hjelp av en spektrofotometer, og mengdene som brukes for multiplex PCR. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
-
PCR forsterkning
- Utfør fluorescerende mikrosatellittmarkør genotyperingteknologi ved hjelp av et multiplex STR-system (tabell med materialer).
- Bruk PCR-forholdene vist i Figur 4 for PCR-forsterkningen ved hjelp av multiplex str-systemet (tabell med materialer).
Merk: Følgende primere brukes i dette multiplex STR-systemet: D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, Penta E, FGA, TPOX, D8S1179, vWA, Amelogenin, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317, D5S818 og Penta D.
Figur 4: PCR syklus forhold for multiplex str-systemet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
-
Løs PCR-produktene ved kapillær elektroforese.
- Stopp 1 μL av hver forsterket prøve i 0,5 μL av multiplex systemets interne standard kjørefelt og 9,5 μL av svært deionisert formamid (tabell over materialer).
- Kjør prøver gjennom en kapillær elektroforese instrument (tabell av materialer) ved hjelp av en passende separasjon matrise (tabell av materialer) for instrumentet og multiplex systemets fargestoff sett.
- Data analyse
- Analyser dataene med en analyseprogramvare for DNA-fragment, og sammenlign POC-alleler med foreldrenes alleler for å bestemme opprinnelsen.
- Sett opp en størrelse standard.
Merk: Dette gjør at programvaren kan gjenkjenne stigen som brukes i multiplex STR-systemet, og å tildele basepairs til amplicons basert på stigen. Følgende trinn gjelder for en bestemt programvare (tabell av materialer), men kan være til hjelp for å sette opp andre typer programvare også.- Åpne programvaren. Klikk på Start nytt prosjekt og deretter på ny størrelse standard.
- Gi størrelsen standard et navn (f. eks, ABI_600).
- I boksen som heter angi ny størrelse standard definisjon: Skriv inn følgende: 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600. Klikk deretter på Legg til størrelse (er).
Merk: tallene angitt vises under boksen til høyre, som heter nåværende størrelse standard Definition (se figur 5). - Klikk på Lagre.
- For å importere og analysere en fil, klikk på Legg til filer, og velg FSA-filen som skal analyseres. Falle i staver opp på sammenlegge valgt fil-størrelse og så opp på OK. Deretter følger du denne fremgangsmåten:
- Finn kolonnen standard , og velg ABI_600 (eller navnet som ble gitt til standard størrelse).
- Under analysemetode, klikk på DIMENSJONERING standard-NPP og klikk deretter på den grønne analyser knappen.
- Filen er nå klar for visning. Juster visningsalternativene for å vise dataene etter behov.
- Feilsøking-analysemetode
Merk: Programvaren kan noen ganger ikke klarer å identifisere topper og justere dem riktig. Dette skjer når toppene er enten for lavt eller for høyt. Følgende to analysemetoder kan korrigere for dette og bør prøves før en prøve er testes.- Analysemetode 1 for høye topper:
- Klikk på ny analysemetode og gi den navnet høy Peaks (eller et annet navn som per personlig preferanse).
- Klikk på Range og deretter på delvis Range for analyse og dimensjonering. Skriv deretter inn 100 for startpunktet og startstørrelsen.
- Angi 10 000 for Stopp punktet. Angi 1000 for Stopp størrelse.
- Deretter klikker du på minimum topp høyder og endre tallene slik at toppen terskelen for fargene er som følger: blå: 50; Grønn: 50; Gul: 20; Rød: 100; Oransje: 5000.
- Lagre den nye analysemetoden.
- Analysemetode 2 for lave topper:
- Klikk på ny analysemetode og navngi den Low Peaks (eller et annet navn som per personlig preferanse).
- Klikk på Range og deretter på delvis Range for analyse og dimensjonering. Skriv deretter inn 100 for startpunktet og startstørrelsen.
- Angi 10 000 for Stopp punktet. Angi 1000 for Stopp størrelse.
- Så falle i staver opp på kvalitet flagg og endre det admission card omfang slik det den leser fra 0,5 å 1. Endre det lav kvalitet omfang slik det den leser fra 0,0 å 0,0. Endre forutsetter linearitet til følgende: fra (BP) 100,0 til (BP) 800,0.
- Lagre den nye analysemetoden.
Merk: Det er nå mulig å Reanalyser en fil ved å velge Low Peaks eller High Peaks under analysemetode og deretter klikke på den grønne analyser -knappen.
- Analysemetode 1 for høye topper:
Figur 5: skjermbilde som viser størrelse standard editor. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2. Flow flowcytometri
-
Velge den ideelle FFPE-blokken
- Bruk H & E-slides og et lett mikroskop til å velge en FFPE-blokk som har omtrent 50 − 70% av sitt vev bestående av CV.
Merk: figur 6 er et representativt eksempel på en passende blokk for Flow flowcytometri analyse, som det er sammensatt av cirka 50% CV (høyre halvdel av seksjonen) og 50% mors vev (venstre halvdel). Tilstedeværelsen av mors vev er viktig fordi de fungerer som en intern kontroll for diploid peak. - For blokker som ikke har den ideelle mengden CV, berike for CV som snitting utføres. For å gjøre dette, Identifiser hvilken side av de ferske seksjonene inneholder flere CV i henhold til den tilsvarende H & E Slide. Basert på det, bruk et blad til å skjære av den andre halvparten som må kastes for å berike for CV.
Merk: figur 7 viser en blokk som ikke har tilstrekkelig CV for flyt flowcytometri analyse. For blokker som dette, må delene kuttes slik at halvparten som inneholder mindre CV blir forkastet for å øke mengden av CV med hensyn til mors vev, som vist i figuren. Pass på å kutte flere seksjoner for å kompensere for hva som kastes.
- Bruk H & E-slides og et lett mikroskop til å velge en FFPE-blokk som har omtrent 50 − 70% av sitt vev bestående av CV.
Figur 6: H &Amp; E-delen som representerer en POC-blokk som er ideell for strømnings flowcytometri. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: H &Amp; E-delen som representerer en vanskeligere blokk for strømnings flowcytometri. Denne representanten H & E delen viser at bare den nedre halvdelen av denne seksjonen skal brukes for Flow flowcytometri analyse, med mål om berikende for CV. Det skisserte området, merket "CV", består for det meste av CV. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Snitting
- La blokkene på isen i 15 minutter for å lette snitting.
- Ved hjelp av best mulig FFPE blokk, kutt fire seksjoner som er 50 μm tykke (eller 2 100 μm tykke seksjoner) ved hjelp av en mikrotomen.
Merk: For flyt flowcytometri er det best å ha tykkere seksjoner. - I det tilfelle at en ideell FFPE blokk er ikke tilgjengelig, har som mål å opprettholde forholdet mellom CV til mors vev likevel. For eksempel, hvis bare 30% av blokken består av CV mens resten har mors vev, deretter fjerne minst halvparten av den delen som inneholder mors vev og bruke flere seksjoner for å kompensere (se figur 7).
- Plasser seksjonene i merket 15 mL rør.
Merk: Sørg for å tape over etikettene fordi de organiske reagensene som brukes i neste trinn, kan oppløse og fjerne blekk.
- Flow flowcytometri protokoll fra FFPE vev
- Deparaffinization og rehydrering
- Utfør følgende vasker (tabell 3) under en avtrekksvifte.
- Fyll 15 mL rør med 6 mL riktig reagens, følg rekkefølgen som er presentert i tabell 3, la delene i reagensene for den respektive varigheten, og fjern deretter reagens ved hjelp av vakuum suging og et glass Pasteur-pipette.
- Mellom hvert trinn, dyppe Pasteur pipette først i 70% etanol, deretter i destillert vann, og deretter gå videre til neste trinn.
- Vær svært forsiktig med å fjerne biter av vev sammen med reagens. Vipp 15 mL rør til en 60-graders vinkel for å gjøre det lettere å suge opp væske reagens uten å tegne vev.
Forsiktig: De kasserte væsker inneholder xylen og bør kastes i xylen Avfallsbeholdere.
- Forberedelse av løsningen
- Forbered citrate løsning ved å oppløse 2 g sitronsyre i 1 L av dobbel destillert vann. Bring pH til 6. Oppbevares ved 4 ° c.
- Forbered pepsin løsning ved å oppløse 0,01 g av pepsin i 2 mL 9 deler per tusen NaCl, pH 1,64. Dette er for en prøve.
Forsiktig: Pepsin er giftig og kan lett spre og bli luftbårne. Bruk en maske når du håndterer pepsin i pulverform og tørk av alt arbeidsområdet etter at du har brukt det. - Propidium iodide (PI)-ribonuklease en løsning forberedelse for en prøve.
- Bland 50 μL av PI med 450 μL av PBS (for å fortynne 10x).
- Tilsett 50 μL av ribonuklease A (1 mg/mL) i blandingen. Hold innpakket i folie hele tiden.
- Fordøyelse og farging
- Tilsett 4 ° c citrate løsning på 15 mL rør deretter plassere i en 80 ° c vannbad for 2 t.
- La løsningen avkjøles til romtemperatur (15 min). Fjern citrate løsning.
- Tilsett 6 mL 1x PBS, Vortex, og vent 1 − 2 min for å la vevet til å bosette seg til bunnen. Fjern 1x PBS ved hjelp av vakuum sug og et glass Pasteur-pipette.
- Tilsett 1 mL pepsin oppløsning (forvarmet til 37 ° c) og plasser i et 37 ° c tørt bad i 30 min. Vortex hver 10 min. klargjør PI-ribonuklease en løsning i de siste 10 min av denne inkubasjons.
- Tilsett 6 mL 1x PBS, Vortex, og vent 1 − 2 min for å la vevet til å bosette seg til bunnen. Fjern 1x PBS ved hjelp av vakuum sug og et glass Pasteur-pipette.
- Tilsett 550 μL av PI-ribonuklease en løsning og plasser prøvene i et 37 ° c tørt bad i 30 minutter.
Merk: På dette punktet, kan prøvene være innpakket i folie og venstre over natten ved 4 ° c til neste morgen. - Filtrer løsningen ved hjelp av et filtrerings nett i 48-μm. Samle Filtrer i polystyren runde-bunn rør, som kan brukes med Flow flowcytometer. Bruk tang til å plassere en 5 cm med 5 cm stykke filtrerings nett i den øverste delen av røret, slik at væsken kan Pipet tert gjennom mesh og inn i røret.
Merk: Prøvene er nå klare til å bli kjørt med Flow flowcytometer. Hold dem innpakket i folie til de er klare til å kjøres.
- Kjør prøver med en flyt-flowcytometer ved hjelp av organisasjonens flyt flowcytometri plattform tekniker.
Merk: PE-kanalen brukes til å oppdage PI-beiset DNA og strømningshastigheten bør settes til langsom under anskaffelse. Sørg for at spenningen er valgt slik at diploid toppen er omtrent på 200 langs PE-A x-aksen for å forenkle analyse og tolkning. Ta sikte på å spille inn minimum 20 000 hendelser per prøve.
- Deparaffinization og rehydrering
| Reagens som brukes (6 mL hver) | Varighet |
| 1) xylen | 2 x 10 min |
| 2) 100% etanol | 2 x 10 min |
| 3) 95% etanol | 10 min |
| 4) 70% etanol | 10 min |
| 5) 50% etanol | 10 min |
| 6) destillert vann | 2 x 10 min |
Tabell 3: reagenser og varigheter for deparaffinization og rehydrering.
-
Dataflyt flowcytometri dataanalyse
- Analyser data med en flyt flowcytometri analyseprogramvare (tabell av materialer).
Merk: Følgende trinn gjelder for en bestemt programvare (tabell av materialer), men kan være til hjelp for å sette opp andre typer programvare også.- Etter å ha kjørt prøvene på en Flow flowcytometer, Last ned FCS 2,0 filer for analyse.
- Åpne flyt flowcytometri analyseprogramvare, klikk på fil | Nytt dokument.
- Klikk histogram ikonet (
), og dra deretter pekeren for å lage et rektangel. - Bla gjennom etter FCS-filen, og klikk deretter på Åpne. Langs x-aksen klikker du på FCS-a og velger deretter PE-a.
- Klikk på prikk plot-ikonet (
) og dra deretter pekeren for å opprette et annet rektangel under histogram plottet. Deretter blar du etter den samme FCS-filen som ble valgt for histogrammet. - Endre x-aksen i prikk plottet til PE-A og y-aksen til PE-W.
Merk: Figur 8A demonstrerer utseendet på tomter på dette punktet. - Klikk på region-ikonet (
) og tegn en boks på prikken tomten som starter før diploid Peak (rundt 100 på x-aksen i Figur 8B) og som ender rundt 700 på x-aksen, som vist i prikken plottet i Figur 8 B.
Merk: Den diploid toppen i Figur 8 er omtrent på 200 på x-aksen. Dette velges vilkårlig som prøvene er registrert gjennom Flow flowcytometer, bare for å forenkle analyse og tolkning av resultatene. - Klikk på Plot | Rediger regioner/porter, og skriv deretter inn R0 i cellen som er ved siden av G0 -cellen under strategi. Deretter klikker du på Lukk.
- Klikk hvor som helst i histogrammet og deretter på Plot | Formater plott/overlegg. Under gate, velge G0 = R0 og så falle i staver opp på OK.
Merk: Dette er gating trinn som gjør at en til bedre visualisere ploidy topper. Histogrammet skal nå se ut som histogrammet i figur 8B. Det er mulig å leke seg med porten opprettet (ved å flytte boksen trukket i trinn 2.4.1.7) for å fokusere på bestemte regioner av prikken tomten. - Hvis du vil merke plott, klikker du på tekstområde ikonet (
), og deretter drar du pekeren for å opprette en boks øverst i dokumentet, og deretter skriver du inn følgende informasjon: pasient-ID, POC-ID og blokken som brukes (siden det kan være flere blokker for en POC) , prosent CV finnes på blokken, spenningen som brukes til å kjøre prøven, og datoen.
- Analyser data med en flyt flowcytometri analyseprogramvare (tabell av materialer).
), og dra deretter pekeren for å lage et rektangel.
) og dra deretter pekeren for å opprette et annet rektangel under histogram plottet. Deretter blar du etter den samme FCS-filen som ble valgt for histogrammet.
) og tegn en boks på prikken tomten som starter før diploid Peak (rundt 100 på x-aksen i Figur 8B) og som ender rundt 700 på x-aksen, som vist i prikken plottet i Figur 8 B.
), og deretter drar du pekeren for å opprette en boks øverst i dokumentet, og deretter skriver du inn følgende informasjon: pasient-ID, POC-ID og blokken som brukes (siden det kan være flere blokker for en POC) , prosent CV finnes på blokken, spenningen som brukes til å kjøre prøven, og datoen.
Figur 8: skjermbilde som viser et histogram og et prikk plott av et representativt utvalg som er ungated (a) og gated (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kompleksiteten av molar vev og det faktum at de kan ha ulike genotyper nødvendiggjør strenge analyser og bruk av flere metoder som morfologiske evaluering, P57 immunhistokjemi, mikrosatellittmarkør genotyperingteknologi, flyt flowcytometri og fisk. For eksempel, en pasient (1790) ble henvist med to PHM som ble funnet å være triploid av Microarray analyse av Pocer bare. Pasienten ble derfor diagnostisert med tilbakevendende PHM. Mikrosatellittmarkør genotyperingteknologi av hennes to "PHM" sammen med DNA av pasienten og hennes partner avslørte at mens pasientens første muldvarp er triploid dispermic (figur 9A), hennes andre "PHM" har en triploid digynic genotype (figur 9 B) og er derfor ikke en PHM, men en ikke-molar spontanabort.
Den første markøren i figur 9A (i svart) viser to topper i POC. Den første toppen stammer fra moren, siden bare moren har en topp på denne størrelsen. Etter samme resonnement, stammer den andre toppen fra faren siden han deler den samme allel. Legg merke til hvordan den andre toppen er mye høyere enn den første, noe som indikerer at det er trolig to doser av samme fars allel i at peak. Mors forurensning, som vil bli forklart i mer detalj senere, er svært minimal i denne POC fordi POC viser en svært liten topp på plasseringen av den andre mors allel.
Den andre markøren i figur 9A (i blått) viser tre topper i POC. To av disse toppene stammer fra far og en fra moren. Dermed er det tydelig igjen fra denne markøren at det er tre alleler til stede i POC, to fra far og en fra moren. Den tredje og fjerde markører i figur 9A er lik den første markøren, og viser også to alleler som kommer fra far og en fra moren.
Siden alle fire markører konsekvent viser tre alleler (etter dose eller ved tilstedeværelse av tre alleler i forskjellige størrelser), to stammer fra far og en fra moren, kan man konkludere med at denne POC er triploid dispermic, og bekrefter diagnosen PHM.
Alle fire markører i figur 9B igjen Vis tre alleler: den første markøren viser to doser i den første toppen som stammer fra mor og en dose i den andre toppen som stammer fra faren. Den andre og fjerde markører viser tre forskjellige topper (dvs. tre forskjellige alleler), hvorav to er fra moren. Den tredje markøren viser en dose i første topp som stammer fra far og to doser i den andre toppen som stammer fra moren. Derfor er dette POC triploid digynic i opprinnelse siden to sett med kromosomer kommer fra mor og ett sett kommer fra far. Det er derfor en ikke-molar spontanabort.
Figur 9: representative genotyperingteknologi resultater for pasient 1790. (A) Velg genotyperingteknologi resultater fra pasientens første oppfatning som viser en triploid dispermic genotype. (B) Velg genotyperingteknologi resultater fra pasientens andre oppfatning som viser en triploid digynic genotype. X-aksen er i basepairs. etikettene og basepair størrelser har blitt utelatt for enkelhet. Y-aksen representerer topp høyde og er tilsvarende utelatt fra tallet for enkelhet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Denne pasienten var i utgangspunktet feildiagnostisert med to PHM og var å bekymre seg for en økt risiko for flere føflekker mens hun hadde en enkelt PHM. Denne saken fremhever begrensningen av SNP Microarray på POC alene. SNP Microarray er en kraftfull metode og er den beste til å oppdage aneuploidies av noen kromosom (trisomies, monosomies, eller ikke-diploid genotyper); men når det utføres på POC alene uten å analysere foreldrenes DNA, kan opprinnelsen til triploidisering ikke bestemmes. For ytterligere forklaringer om genotype analyse og tolkning, henvises det til studien av Murphy et al.16.
Representative resultater vist i Figur 10A er av en triploid unnfangelse. Verdiene til x-aksen representerer det kjernefysiske DNA-innholdet. 200 er for eksempel et vilkårlig tall gitt til celler som inneholder en viss mengde kjernefysisk DNA-innhold. Derfor, en topp på 400 representerer celler som inneholder doble mengden av kjernefysisk DNA-innhold i forhold til 200 peak. Den lille toppen rundt 300 representerer kjernefysisk DNA-innhold som er i mellom 200 og 400 peak og er derfor triploid peak. Legg merke til hvordan en diploid unnfangelse (Figur 10B) ikke inneholder noen topp på 300 verdi.
I noen tilfeller er triploid peak svært subtil (Figur 10C). Når en knapt merkbar triploid Peak er notert, er det viktig å først vurdere mengden av CV som var til stede i avsnittene som brukes for flyten flowcytometri analyse. Hvis seksjonene hadde mindre enn ca 20% CV, så vil det trolig være en ekte triploidisering siden det forventes å være en svært lav topp. Hvis avsnittene som ble tatt hadde store mengder CV, blir POC mistenksom av mosaikk med tilstedeværelsen av en annen diploid cellepopulasjon. Dette kan kontrolleres ved å revurdere genotyperingteknologi resultatene for å se om de passer til en perfekt triploid dispermy eller kan også bekreftes av fisk med sonder fra X-, Y-og 18-kromosomer. Også ved hjelp av programvaren som er beskrevet i denne artikkelen, er det mulig å angi bestemte porter, som beskrevet i § 2.4.1, som tillater brukeren å fokusere på en bestemt region for å berike for triploid celler hvis de virkelig eksisterer.
Figur 10: representative Flow flowcytometri resultater som demonstrerer triploid konsepsjoner i (A) og (C), og en diploid oppfatning i (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HM er unormal menneskelige svangerskap med heterogene årsaker og har ulike histologiske og genotypisk typer, som gjør deres nøyaktige klassifisering og diagnose utfordrende. Histopathological morfologiske evalueringen ble ofte påvist unøyaktig og er derfor upålitelig på egen hånd for å klassifisere HM i CHM og PHM og skille dem fra ikke-molar aborter. Derfor krever en nøyaktig diagnose av HM bruk av andre metoder som multiplex mikrosatellittmarkør DNA-genotyperingteknologi, ploidy analyse ved flyt flowcytometri, ploidy analyse av fisk, og P57KIP2 immunhistokjemi. Hver av disse metodene har sine egne begrensninger og fordeler.
Begrensninger og fordeler av multiplex genotyperingteknologi og Flow flowcytometri
Mors forurensning er en av de vanligste problemene når du arbeider med FFPE vev og kan føre til feildiagnostisering, og dermed fremhever viktigheten av å skille mors fra POC vev. Det er viktig å identifisere mors forurensning for å få en idé om hva du kan forvente av genotyperingteknologi topper og for å hjelpe til med sin tolkning. Hvis nivået av forurensning er for stor og hindrer pålitelig tolkning av resultatene, og deretter gjenta DNA-isolasjon og ekstraksjon, tar ekstra forsiktighet i å fjerne alle mulige mors vev. I områder der morfologi av vevet er ikke klart, er det bedre å fjerne slike regioner for å minimere sjansen for mors forurensning. Den første fordelen med metoden beskrevet i denne protokollen, i tillegg til lavere pris, er at mors vev er fjernet fra lysbildene, mens andre metoder består av å samle POC vev (ved å dekke dem med løsning som polymeriseres når de utsettes for luft og løfte vev) uten å fjerne mors vev. Metoden er beskrevet her slik at en kan ta en ekstra titt på de resterende POC vev, re-rengjøre dem om nødvendig, som ofte er tilfelle, og deretter samle og ekstrakt DNA fra dem. Den andre fordelen er at vi rent vev på uncoverslipped H & E beiset seksjoner, som i stor grad forenkler fjerning av mors vev, i motsetning til bruk av unstained seksjoner og en påsatt dekkglass kart lysbilde. Imidlertid kan de ekstra flekker ytterligere svekke DNA, og dette er kompensert for ved å legge til flere seksjoner.
Tilgjengeligheten av foreldrenes DNA for analysen er en annen utfordring. Tilstedeværelsen av begge foreldrene i stor grad forenkler analyse og tolkning av genotyperingteknologi resultater. Dessverre er det imidlertid ganske ofte slik at farens DNA ikke er tilgjengelig, noe som kan noen ganger komplisere analysen, spesielt i tilfeller der kvaliteten på POC DNA er dårlig på grunn av tidligere fiksering eller langvarig lagring (hyppigere når du arbeider med tilbakevendende HM). Videre mors blod kan ikke alltid være tilgjengelig for DNA-ekstraksjon. I slike tilfeller kan mors DNA utvinnes fra mors livmor vev til stede i FFPE blokkene som tidligere beskrevet16. Også, karakteriserer molar vev som resulterte fra bruk av assistert reproduktiv teknologi kan komplisere mikrosatellittmarkør genotype analyse fordi, i de fleste tilfeller, DNA fra givere (menn eller kvinner) er vanligvis ikke tilgjengelig.
Til slutt, det faktum at større topper har en tendens til å være kortere i forhold til topp høyde er en annen mulig kilde til forvirring, spesielt når topp høyder må brukes for å finne ut om det er to doser eller en dose i en enkelt topp. En måte å overvinne dette på er å alltid huske på at toppene av store allel størrelse (antall Base par) har en tendens til å være kortere, på grunn av degradert natur DNA fra FFPE vev, noe som gjør mindre DNA tilgjengelig for forsterkning av større alleler. I tillegg tar en kortere PCR-fragment forsterkning mindre tid enn en større, og den eksplosive forsterkningen av DNA fører til færre mengder større alleler.
Den største ulempen med strømnings flowcytometri er at triploid forestillinger noen ganger kan gå glipp av, og dette kan skyldes utilstrekkelige mengder CV i blokken. Imidlertid er tilstedeværelsen av en triploid peak en avgjørende indikasjon på en triploidisering. Merk at denne metoden ikke er følsom nok til å oppdage trisomies, tetraploid konsepsjoner eller andre aneuploidies som bruker denne protokollen. Tetraploid konsepsjoner oppdages ikke av denne protokollen fordi Tetraploid topp tilsvarer samme topp av diploid celler i G2-fasen av cellesyklusen.
Å vite disse begrensningene og utfordringene bidrar til å redusere feil. Det er derfor viktig og noen ganger nødvendig å analysere samme vev med ulike metoder, sammenligne resultatene, og sørg for at de er konkordante med hverandre. Hvis de ikke er det, må det vurderes på grunnlag av resultatene, og analysene må gjentas. For de mange tilfellene som viste motstridende resultater, ble avvik løst bare ved å gjenta eksperimentene og ta passende vare for å unngå det opprinnelige problemet. I andre tilfeller ble avvik løst ved å utføre flere metoder som fisk på vevs deler eller ved å utføre ekstra simplex genotyperingteknologi med egnede markører.
Identifisering av mors forurensning
Med hensyn til å identifisere forurensning av POC DNA med mors DNA, vil nivået av forurensning bli reflektert eller gjenkjent av tilstedeværelsen av alle mors alleler på alle Loci i POC, i tillegg til mors allel (e) som er overført til POC.
I Figur 11A, TOPPER stammer fra mors DNA-forurensning er merket med en "c". Legg merke til hvordan hver topp merket med en "c" er også til stede i moren, og vi ser disse "c" topper i alle tre markører. Merk at for den andre markøren (i blått), mors forurensning peak angitt med en "c" er høyere enn hver "c" peak ved den første markøren fordi moren er homozygote for den andre markøren; høyden på miljøgifter er derfor doblet for denne markøren. I denne POC, er det ingen moderskap avledet topper. Med andre ord, denne POC ikke arve noen alleler fra moren. Det er bare en reell topp på hver markør, og denne toppen er ikke til stede i moren. Vi vet derfor at de virkelige toppene må ha kommet fra faren. Med ploidy informasjon fra enten Karyotype eller flyt flowcytometri analyse demonstrere diploidy, er det mulig å konkludere med at denne POC er både androgenetic i opprinnelse og diploid.
Videre er disse tre markører i Figur 11A avslører at det alltid er bare en virkelig topp for hver markør. Bare tre markører er illustrert her, men multiplex kits ofte kommer med mange flere markører som også vil avdekke det samme mønsteret. Siden denne POC er diploid, må det være to doser i hver topp. Med denne informasjonen kan vi konkludere med at dette POC er androgenetic monospermic og er homozygote på hver enkelt markør.
Figur 11B representerer en diploid biparental POC. Den lille svarte linjen over den første toppen av den første markøren (i grønt) representerer den estimerte mengden av forurensning som er til stede i denne virkelige toppen. Den "R" indikerer den virkelige delen av denne toppen kommer fra POC DNA; "c" representerer miljøgifter delen av denne toppen kommer fra mors DNA. Hvordan kan man identifisere nivået av forurensning? Det er mulig, i dette tilfellet, når en markør er heterozygot i moren fordi en av mors alleler er fraværende i POC. Den lille toppen i den første markøren merket med "c", for eksempel, indikerer at dette er det nivået av forurensning som bør forventes for den andre moderskap arvet peak. Følgelig er alle POC topper som er av mors opprinnelse er litt høyere enn farskap arvet toppene på grunn av den lille ekstra mengden av forurensning. For den tredje markøren (i svart) i Figur 11B, er nivået av forurensning forventes å være dobbelt så vanlig mengde (fordi moren er homozygote for denne spesifikke markøren), og man kan derfor antyde at det bare er én dose i første topp i POC.
Figur 11C ILLUSTRERER en triploid dispermic POC. Den første markøren (i grønt) viser tre topper i POC. Siden disse tretoppene har lignende høyder, er det mulig å konkludere med at denne POC sannsynligvis er triploid. Merk at den tredje toppen i denne markøren er kortere enn den første. Dette er ventet fordi, som en generell trend, større topper tendens til å være kortere. Den andre toppen er litt høyere enn den første, og dette kan regnskapsføres av en liten mengde av mors forurensning, som indikert av baren og "c." Videre er to av disse tretoppene ikke tilstede i moren, og må derfor ha kommet fra faren. Så langt, indikerer denne markøren at POC kan være triploid (eller en Trisomi) og at opprinnelsen til den ekstra sett med kromosomer er fars. Det indikerer også at det er en dispermic oppfatning, siden POC arvet to forskjellige alleler fra faren.
Den andre markøren (i blått) i Figur 11C har bare to topper. Etter regnskap for nivået av forurensning, vises den andre toppen høyere enn den første, og dette er til tross for den generelle trenden for større topper til å være mindre (en trend som alltid må holdes i bakhodet under analyse). Dermed er det sannsynlig at det er to doser i at en stor topp. Dette er også støttet av det faktum at den første markøren er en indikasjon på triploidisering.
Til slutt, den tredje markøren (i svart) i Figur 11C viser tre topper, igjen indikasjon på triploidisering. Siden de fleste markører i multiplex kits kommer fra forskjellige kromosomer, er det mulig å konkludere med tillit til at en POC er triploid etter å observere den samme trenden av tre alleler over flere forskjellige markører. Merk også fra denne markøren at to av de tretoppene stammer fra faren, bekrefter dispermic opprinnelse.
Figur 11: genotyperingteknologi resultater som illustrerer effekten av mors forurensning. De øverste panelene viser alleler som tilhører den POC og de nederste panelene viser de som tilhører moren. I (A), er POC androgenetic monospermic og nivået av forurensning er markert med en pil og bokstaven "c." In (B), er POC diploid biparental, og nivået av forurensning er markert med bokstaven "c." I (C), er POC triploid dispermic og nivået av forurensning er markert med bokstaven "C." Den lille svarte striper viser hvor mye av topp høyder kommer fra mors forurensning og bør derfor tas i betraktning når man sammenligner topp høyder. X-aksen er i basepairs. etikettene og basepair størrelser har blitt utelatt for enkelhet. Y-aksen representerer topp høyde og er tilsvarende utelatt fra tallet for enkelhet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Eksempler på utfordrende saker
For en rekke tilfeller var det bare mulig å komme frem til en konklusjon ved å ha alle tre vurderinger samtidig (dvs. flyt, P57KIP2og multiplex genotyperingteknologi). For eksempel, ett tilfelle (808) ble referert som en ikke-molar spontanabort. Histopathological evaluering føre til mistanke om en molar unnfangelsen og genotyperingteknologi analyse av POC avdekket en markør som tydelig viste tre topper (to fra far og en fra mor). Den P57KIP2 resultatene var ikke avgjørende. Flyten flowcytometri analysen avdekket en liten triploid peak som ble bekreftet med FISH analyse, som også utelukkes tilstedeværelsen av en annen diploid mobilnettet befolkning. Med bekreftelse fra fisk, var det mulig å konkludere med at POC er virkelig en triploid dispermic muldvarp.
En annen sak (1192) ble også referert som ikke-molar spontanabort. CV av denne POC ble blandet med mors vev og var svært nekrotisk også, noe som gjør rengjøringsprosessen svært utfordrende. Følgelig viste den første genotyperingteknologi analysen et høyt nivå av mors forurensning, slik at hver mors allel kunne sees i POC (en god indikasjon på mulig forurensning). Videre var P57KIP2 dessverre mangelfulle, mest sannsynlig på grunn av nekrotisk natur vev, kanskje på grunn av forsinket fiksering. Flyten flowcytometri resultatene, derimot, var en indikasjon på triploidisering, som også ble bekreftet av fisk. DNA ble re-utvunnet med mål om å redusere nivået av forurensning og fjerne vev med uklart morfologi. Analyse av den nye genotyperingteknologi resultater, mens regnskap for den sannsynlige tilstedeværelsen av mors forurensning, tillot oss å konkludere med at POC var en triploid dispermic XXY PHM.
Tabell 4 skisserer de typiske metodene som brukes for analyse. Det anbefales å bruke morfologiske evaluering og P57KIP2 immunhistokjemi på alle vev mistenkelig av HM og minst én genotyperingteknologi metode. Blant genotyperingteknologi metoder, den mest informative er multiplex DNA genotyperingteknologi. Når resultater mellom ulike metoder ikke er konkordante, eller når noen resultater ikke er entydige, må andre genotyperingteknologi metoder brukes. Tabellen demonstrerer forventet konkordante resultater for hver mulige HM type sammen med sjeldne unntak og anbefalinger for å løse dem.
Tabell 4: typisk analyse rekkefølge, forventede resultater og sjeldne unntak samt anbefalinger for å løse dem. P57KIP2 immunhistokjemi tar sikte på å oppdage uttrykk for P57KIP2, proteinet kodet av CDKN1C Gene. Dette genet er farskap trykt i cytotrophoblast og villous stroma av første trimester placenta og uttrykkes bare fra mors Genova. Det er derfor brukt som en hjelpeutstyr markør for å oppdage, på en enkel og rimelig måte, tilstedeværelsen av mors Genova i POC. Det anbefales å utføre P57KIP2 immunhistokjemi for alle pocer mistenkt å være hm parallelt med morfologiske evaluering. I forfatterens laboratorium, P57KIP2 antistoff og plattformer som er angitt i tabellen av materialer er brukt og forfatterne er veldig fornøyd med kvaliteten på resultatene. Forkortelser: IHC = immunhistokjemi; DIP og = diploid androgenetic; DIP BIP = diploid biparental; Chr = kromosom; MC = spontanabort; og TP = trofoblastiske spredning.
Til beste av forfatternes kunnskap, denne artikkelen er den første til å gi detaljerte protokoller for Flow flowcytometri samt lave kostnader og høy kvalitet multiplex mikrosatellittmarkør DNA genotyperingteknologi av FFPE POC vev. Tolkningen av resultatene er også beskrevet, sammen med deres feilsøking og integrasjon med andre metoder for å nå nøyaktige konklusjoner og diagnoser av Pocer og HM. Forfatterne håper inderlig at denne artikkelen kan være nyttig for forskere prøver å forstå denne komplekse enheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Sophie Patrier og Marianne Parésy for å dele den opprinnelige flyten flowcytometri protokollen, og Promega og Qiagen for å gi forsyninger og reagenser. Dette arbeidet ble støttet av Réseau Québécois no reproduksjon og Canadian Institute for Health Research (MOP-130364) til R.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer - flow cytometry analysis software | SourceForge | - | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | - | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 μm | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Szulman, A. E., Surti, U. The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).
- Fukunaga, M., et al. Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole. The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).
- Gupta, M., et al. Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).
- Howat, A. J., et al. Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy? Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).
- Banet, N., et al. Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping. Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).
- Lipata, F., et al. Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole. Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).
- Buza, N., Hui, P. Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).
- Fisher, R. A., et al. Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes. Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).
- Murdoch, S., et al. Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans. Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).
- Parry, D. A., et al. Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte. American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).
- Nguyen, N. M., Slim, R. Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling. Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).
- Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations. Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).
- Nguyen, N. M., et al. Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation. Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).
- Brown, L., et al. Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either "partial" or "complete" hydatidiform moles. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).
- Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping. The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).
- Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).
