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Cancer Research

इंटरस्केपुलर व्हाइट फैट पैड में चूहा मैमेरी एपिथेलियल सेल प्रत्यारोपण

Published: March 4, 2020 doi: 10.3791/60401
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Oncology, McArdle Laboratory for Cancer Research, University of Wisconsin-Madison School of Medicine and Public Health

Summary

यह लेख प्राप्तकर्ता जानवरों के इंटरस्केपुलर सफेद वसा पैड में दाता चूहा स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं को भ्रष्टाचार करने के लिए एक प्रत्यारोपण विधि का वर्णन करता है। इस विधि का उपयोग मैमेरी एपिथेलियम विकास पर मेजबान और/या दाता प्रभावों की जांच करने के लिए किया जा सकता है और पूर्व-समाशोधन की आवश्यकता को समाप्त कर देता है, जिससे इस तकनीक की उपयोगिता का विस्तार होता है ।

Abstract

1970 के दशक के रूप में जल्दी, शोधकर्ताओं ने सफलतापूर्वक चूहों के interscapular सफेद वसा पैड में स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं प्रत्यारोपित किया है । प्रत्यारोपण तकनीकों का उपयोग करग्राफ्टिंग मैमरियल एपिथेलियम किशोर कृंतक मेजबान द्वारा प्रदान किए गए हार्मोनल वातावरण का लाभ उठाता है। ये अध्ययन आदर्श रूप से स्तन ग्रंथि विकास पर विभिन्न जैविक जोड़तोड़ के प्रभाव का पता लगाने और स्तन ग्रंथि जीव विज्ञान के कई पहलुओं को विच्छेदन करने के लिए अनुकूल हैं। एक आम, लेकिन सीमित, सुविधा यह है कि प्रत्यारोपित एपिथेलियल कोशिकाएं आसपास के स्ट्रोमा से दृढ़ता से प्रभावित होती हैं और एंडोजेनियस एपिथेलियम से आगे निकल जाती हैं; देशी स्तन ऊतक का उपयोग करने के लिए, प्रत्यारोपण से पहले मेजबान मैममैरी एपिथेलियम को हटाने के लिए पेट-इंगिनल सफेद वसा पैड को मंजूरी दी जानी चाहिए। चूहा मॉडल जीव का उपयोग करते समय एक बड़ी बाधा यह है कि बाद के चूहों में विकासशील स्तन पेड़ को साफ करना कुशल नहीं है। जब ग्रंथि मुक्त वसा पैड में प्रत्यारोपित, दाता एपिथेलियल कोशिकाओं को मंजूरी दे दी मेजबान वसा पैड फिर से आबाद और एक कार्यात्मक स्तन ग्रंथि फार्म कर सकते हैं । इंटरस्केपुलर फैट पैड इन ग्राफ्ट के लिए एक वैकल्पिक स्थान है। एक बड़ा लाभ यह है कि इसमें डक्टल संरचनाओं का अभाव है फिर भी सामान्य स्ट्रोमा प्रदान करता है जो एपिथेलियल आउटग्रोथ को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक है और चूहे में आसानी से सुलभ है। इस तकनीक का एक और बड़ा लाभ यह है कि यह न्यूनतम आक्रामक है, क्योंकि यह बढ़ते एंडोजेनस मैममैरी पेड़ को कोटेरइज़ करने और हटाने की आवश्यकता को समाप्त करता है। इसके अतिरिक्त, इंटरस्केपुलर फैट पैड में एक मध्यरक्त वाहिका होती है जिसका उपयोग ग्राफ्टिंग के लिए साइटों को अलग करने के लिए किया जा सकता है। क्योंकि एंडोजेनस ग्रंथियों बरकरार रहते हैं, इस तकनीक का उपयोग प्रत्यारोपित ग्रंथि से एंडोजेनस मैममैरी ग्रंथि की तुलना में अध्ययन ों के लिए भी किया जा सकता है। यह पेपर चूहों के इंटरस्केपुलर वाइट फैट पैड में मैममैरी एपिथेलियल सेल प्रत्यारोपण की विधि का वर्णन करता है।

Introduction

प्रसवोत्तर स्तन ग्रंथि विकास और डक्टल मॉर्फोजेनेसिस काफी हद तक यौवन की शुरुआत में हार्मोनल सिग्नलिंग से प्रभावित प्रक्रियाएं हैं। चूहों और चूहों में, आमतौर पर स्तन ग्रंथि जीव विज्ञान के मॉडल जीवों का उपयोग किया जाता है, यह प्रक्रिया लगभग 3 सप्ताह की उम्र शुरू होती है, जहां परिपक्व पारेंचिमा के गठन में तेजी से प्रसार और भेदभाव परिणाम होता है। परिपक्व स्तन ग्रंथि विस्तार और involution, एक संपत्ति है कि 20वीं सदी के शुरू के बाद से जांच के अधीन किया गया है के कई दौर से गुजरना कर सकते हैं । अतिप्रसार और कैंसर के विकास के संदर्भ में, 1 9 50 केदशकमें मैमेरी ग्रंथि प्रत्यारोपण तकनीकविकसित की गई थी, और 1 9 772,3,4में गोल्ड एट अल द्वारा योगदान की गई मात्रात्मक पद्धति द्वारा बढ़ाया गया था। कृंतक में प्रत्यारोपण तकनीक के शोधन ने सामान्य स्तन ग्रंथि जीव विज्ञान को समझने में प्रमुख प्रगति में योगदान दिया है जो अभी भी सामान्य स्तन ग्रंथि और रोग राज्यों पर विभिन्न उपचारों और आनुवंशिक हेरफेर के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है।

कई परिकल्पनाओं को उत्पन्न किया गया है और बाद में मैमेरी ग्रंथि प्रत्यारोपण का उपयोग करके परीक्षण किया गया है, जो पहले 1 9 5 91में डेउम एट अल द्वारा वर्णित था। कई दशकों मेंप्रयोगों ने पूरे वसा पैड5,6,7 को फिर से आबाद करने के लिए दाता स्तन ग्रंथियों से उत्पादित डक्टल ऊतक की प्रवृत्ति दिखाई और संकेत दिया कि मैमारी ग्रंथि विकास का एक महत्वपूर्ण घटक इन विशेषण संरचनाओं में रहता है। चूहों में बाद में किए गए अध्ययनों से पता चला है कि एक एकल स्तन स्टेम सेल एक साफ वसा पैड को फिर से आबाद कर सकता है और बेसल और ल्यूमिनल मैमियल एपिथेलियल कोशिकाओं8,9,10के एक एकल, आम जनक की खोज में योगदान दे सकता है। इन निष्कर्षों के अनुरूप, यह सुझाव दिया गया है कि प्रत्यारोपण प्लास्टिसिटी के परिणामस्वरूप मल्टीलाइनेज-रीआबाद क्षमता वाली कोशिकाओं के पूल को बढ़ाता है, जिससे ग्राफ्टकीड कोशिकाओं को एक कार्यात्मक स्तन ग्रंथि7,10,11,12, 13विकसित करने की अनुमति होती है। महत्वपूर्ण बात, कृंतक में प्रत्यारोपण तकनीकों का उपयोग सेल संस्कृति-प्रेरित असामान्यताओं14 की सीमाओं पर काबू पा जाता है और अक्सर सप्ताह के सिर्फ एक मामले में परिणाम प्रदान करता है।

जबकि प्रक्रिया मूल रूप से चूहों में preneoplastic घावों के संदर्भ में वर्णित किया गया था, यह जल्द ही चूहों के लिए विस्तारित किया गया था और कैंसर संवेदनशीलता15के एक उपाय के रूप में बहुलता स्थापित करने के लिए कैंसरजनक उपचार के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया, लेकिन प्रत्यारोपण तकनीकों की लोकप्रियता प्रत्येक प्रजातियों के लिए आनुवंशिक उपकरणों के विकास का पालन किया है । हालांकि प्रत्यारोपण को शामिल माउस अध्ययन कई अनुवाद निष्कर्षों का योगदान दिया है, चूहा स्तन ग्रंथि के parenchyma मानव और अधिक बारीकी से16,17 जैसा दिखता है और एस्ट्रोजन रिसेप्टर पॉजिटिव (ईआर +) स्तन कैंसर का अध्ययन करने के लिए अलग लाभ प्रदान करता है । मैमेरी ट्यूमर दोनों प्रजातियों में अप्रेबल हैं, लेकिन वे हार्मोन संवेदनशीलता और जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल के मामले में अलग हैं। एक प्राथमिक अंतर यह है कि चूहा स्तन ट्यूमर व्यक्त करता है और अंडाशय और पीयूष हार्मोन रिसेप्टर्स के कार्य पर निर्भर करता है, अर्थात् एस्ट्रोजन और प्रोजेस्टेरोन (पीआर), चमकदार-मानव स्तन कैंसर के एक उपप्रकार के समान। दरअसल, स्तन एपिथेलियल सेल प्रत्यारोपण, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, स्तन कैंसर में शामिल आनुवंशिक वेरिएंट का अध्ययन करने और स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं18पर प्रभाव की सेलुलर स्वायत्तता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।

ट्यूमर जीव विज्ञान के अलावा, सामान्य चूहा स्तन ग्रंथि का डक्टल एपिथेलियम शाखाओं के उच्च स्तर को प्रदर्शित करता है और माउस की तुलना में स्ट्रोमा की एक मोटी परत से घिरा हुआ है। स्ट्रोमा का महत्व मैमरियल एपिथेलियल प्रत्यारोपण अध्ययन में अच्छी तरह से प्रलेखित है। मैमेरी एपिथेलियम को फैटी स्ट्रोमा के साथ बातचीत करनी चाहिए, और आदर्श रूप से अपने मेसेनचिम को अपनी विशेषता मॉर्फोजेनेसिस19,20से गुजरना चाहिए। एक प्राप्तकर्ता स्तन ग्रंथि में ऊतक ग्राफ्टिंग एक इष्टतम वातावरण प्रदान करता है; हालांकि, एंडोजेनस एपिथेलियम की उपस्थिति परिणामों में हस्तक्षेप कर सकती है। एंडोजेनस एपिथेलियम की मैमेरी ग्रंथि को पूर्वसमाशोधन करना आमतौर पर माउस प्रत्यारोपण परखमें किया जाता है और इसके लिए एंडोजेनस मैममैरी ऊतक के शल्य चिकित्सा लक्षण और/या निप्पल1,21,22को हटाने की आवश्यकता होती है । हालांकि संभव है, पोस्ट-वेलिंग चूहों में मैममैरी एपिथेलियम को प्रीक्लियर करना व्यापक रूप से प्रदर्शन नहीं किया जाता है, मुख्य रूप से पोस्ट-वेलिंग चूहों में बढ़ते मैमरी पेड़ को साफ करने की प्रभावहीनता के कारण। चूंकि यह दिखाया गया है कि शरीर में कहीं और एडीपोस ऊतक के क्षेत्र प्रत्यारोपित मैमरी एपिथेलियम21,23,24के विकास का समर्थन कर सकते हैं, इसलिए ऊतकों में इंटरस्केपुललर सफेद वसा पैड में ऊतक ग्राफ्टिंग करके प्रीक्लीयरिंग की प्रक्रिया को आसानी से चूहों में टाला जा सकता है।

इस पेपर में वर्णित प्रत्यारोपण विधि में एंजाइम़िक रूप से डिसोसिएटेड मैममैरी ग्रंथि ऑर्गेनॉइड (मॉर्मोजेनेसिस में सक्षम मैममैरी डक्टल एपिथेलियम और अन्य कोशिकाओं के टुकड़े प्रकार) या प्रयोगशाला चूहों के अंतरस्केपुलर फैट पैड में मोनोस्फेवकोशिकाओं, आइसोजेनिक या प्रयोगशाला चूहोंकेकंजेनिक उपभेदों का इंजेक्शन शामिल है। क्योंकि इंटरस्केपुलर फैट पैड सामान्य रूप से स्तन ऊतक से रहित होता है, यह एंडोजेनस एपिथेलियम को पूर्व-स्पष्ट करने की आवश्यकता के बिना कई प्रत्यारोपण साइटों के लिए एक उपयुक्त वातावरण प्रदान करता है। नतीजतन, मेजबान जानवर की एंडोजेनस, पेट-इंगिनल मैममैरी ग्रंथियां शल्य चिकित्सा हेरफेर के अधीन नहीं हैं, सामान्य रूप से विकसित होती हैं, और परिणामों की व्याख्या में हस्तक्षेप नहीं कर सकतीहैं। इसके अतिरिक्त, बरकरार मैममैरी ग्रंथियों का उपयोग मैमरी एपिथेलियम विकास और ट्यूमरिजेनेसिस18,25पर मेजबान बनाम दाता प्रभावों का मूल्यांकन करने की तुलना के लिए किया जा सकता है। हालांकि चूहों के लिए एक स्टेम सेल से स्तन ग्रंथि की पुनर्जनसंख्या उपलब्ध है, लेकिन इसे चूहे के लिए अभी तक विकसित नहीं किया गया है, मुख्य रूप से चूहे स्तन स्टेम कोशिकाओं25,26,27के लिए चयन करने के लिए एंटीबॉडी की उपलब्धता की कमी के कारण। इसके बावजूद, पुनर्आबाद क्षमता की मात्रा निर्धारित करने के लिए मोनोस्पेग्ड मैममैरी एपिथेलियल कोशिकाओं काप्रत्यारोपण सफलतापूर्वक किया जा सकता है, और उचित फ्रेमवर्क2,3,4में ग्राफ्ट होने पर उन कोशिकाओं का सामान्य रूप से विकास होगा। जबकि ऑर्गेनॉइड कई उद्देश्यों के लिए अच्छे हैं, उदाहरण के लिए, मात्रात्मक अनुप्रयोगों के लिए मोनोस्फेइड कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, उदाहरण के लिए, आयनीकरण विकिरण उपचार28 के बाद कैंसर दीक्षा के लिए आवश्यक मैममैरी एपिथेलियल कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए या प्रवाह साइटोमेट्रिकल रूप से चयनित मैमाइएरियल एपिथेलियल सेल आबादी29की विशेषताओं की तुलना करने के लिए।

आज तक, यहां वर्णित प्रक्रिया स्तन कैंसर के विकास और स्तन कैंसर के विकास में अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के समग्र लक्ष्य के साथ चूहे में स्तन ग्रंथि प्रत्यारोपण करने का सबसे मजबूत तरीका है। अक्सर, दाता और/या प्राप्तकर्ता जानवरों से पहले, के दौरान, या एपिथेलियल प्रत्यारोपण के बाद अलग चर के संपर्क में हैं । उदाहरणों में रासायनिक कार्सिनोजेनेसिस30, विकिरण28,31,32, मेजबान/दाता जीनोम 18 का आनुवंशिक हेरफेर और हार्मोनल हेरफेर12शामिल हैं । इस प्रोटोकॉल में वर्णित एंजाइमैटिक विच्छेदन का एक प्रमुख लाभ प्रवाह साइटोमेट्री, 3-डी संस्कृति, जीन संपादन, और अधिक शामिल पूरक प्रयोगों के लिए एपिथेलियन ऑर्गेनॉइड या मोनोस्पेग्ड कोशिकाओं को अलग करने का अवसर है। इस तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों में दाता के अतिरिक्त हेरफेर और/या आनुवंशिक इंजीनियरिंग के साथ ऊतक की मेजबानी शामिल होंगे । उदाहरण के लिए, दाता कोशिकाओं को CRISPR-Cas9 जीन संपादन प्रणाली का उपयोग कर किसी भी चुने हुए जीनोमिक लोकस पर आनुवंशिक रूप से पूर्व वीवो को बदला जा सकता है। इसी तरह, प्राप्तकर्ता चूहों को भी आनुवंशिक रूप से दाता और प्राप्तकर्ता इंजीनियर आनुवंशिक कारकों के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए बदला जा सकता है ।

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Protocol

सभी जानवरों को AAALAC-अनुमोदित सुविधा में रखा गया था, और इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगों को MUSC इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। पारस्परिक प्रत्यारोपण में उपयोग के लिए पशु एक inbred या आइसोजेनिक तनाव होना चाहिए, जिसमें कम से कम 6 पीढ़ियों के लिए कॉन्जेनिक स्थिति पसंद या बैकक्रॉस की गई हो।

1. हार्वेस्टिंग दाता चूहा स्तन ग्रंथि एपिथेलियम

  1. प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक दाता चूहों की संख्या निर्धारित करें।
    नोट: आम तौर पर, 1 दाता चूहा (उम्र के 4 सप्ताह) 4 प्राप्तकर्ता जानवरों में प्रत्यारोपण के लिए पर्याप्त कोशिकाओं प्रदान कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल के कुछ अनुप्रयोगों को कोशिकाओं की अतिरिक्त संख्या की आवश्यकता होगी, और कुल उपज में तनाव-विशिष्ट अंतर हो सकते हैं।
  2. सभी आपूर्ति लेबल और सर्जन(तालिका 1)के लिए सुलभ प्लेसमेंट सुनिश्चित करें ।
  3. प्रत्येक महिला दाता चूहे के शरीर के वजन को रिकॉर्ड करें। दाता चूहे को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज़ या इच्छामृत्यु देने के लिए संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करें। अंगूठे चुटकी के जवाब की कमी से संज्ञाहरण की गहराई के लिए जांच करें।
  4. जानवर को बाँझ सर्जिकल क्षेत्र में ले जाएं। जानवर को अपनी पीठ पर रखें और 70% इथेनॉल के साथ पूरी वेंट्रल सतह का छिड़काव करें।
  5. एक सजीटल, एक्स के आकार का चीरा बनाएं, जिससे छाती, पेट और इंगिनल मैममैरी ग्रंथियों तक पहुंच की अनुमति मिलती है। कैंची(चित्रा 1)का उपयोग करदाता चूहे से सभी स्तन ग्रंथि ऊतक विच्छेदन । सभी दिखाई लिम्फ नोड्स निकालें।
  6. बर्फ पर एक लेबल 60 मिमी पकवान में संदंश और जगह का उपयोग कर स्तन ऊतक निकालें। 60 एमएम डिश में सीरम-फ्री डीएमईएम/F12 मीडिया के 500 माइक्रोन जोड़ें। स्तन ग्रंथि ऊतक के प्लेसमेंट को समायोजित करें ताकि यह पूरी तरह से गीला रहे।
  7. बारीक कैंची का उपयोग कर स्तन ऊतक कीमा । ऐसा करने के लिए, ऊतक को आकार में 1-2 मिमी3 टुकड़ों में काट लें(चित्रा 1सी)। सभी दाता ऊतक काटा गया है जब तक बर्फ पर ग्रंथि रखें (६० मिन से अधिक नहीं है) ।
    नोट: अतिरिक्त कर्मियों मैममैरी ग्रंथियों कीमा और इसके अतिरिक्त कोलेजन समाधान तैयार कर सकते हैं, जबकि सर्जन ऊतक निष्कर्षण के साथ आय ।

2. इच्छामृत्युदाताओं से मस्तिष्क के ऊतकों को निकालें

  1. ध्यान से दाता जानवर के शरीर को एक प्रवण स्थिति में रखने के लिए चालू करें। पिन के साथ सुरक्षित। 70% इथेनॉल के साथ सिर और ऊपरी पीठ स्प्रे करें।
  2. खोपड़ी के आधार का पता लगाएं और ऑक्सीपिटल मसालों के नीचे एक चीरा बनाएं। त्वचा के नीचे तेज कैंची डालें और त्वचा को खोपड़ी से दूर काट दें, जिसमें सिर के किनारों भी शामिल हैं।
  3. ऑक्सीपिटल से ललाट हड्डियों तक, मिडलाइन के साथ खोपड़ी को काटने के लिए बोन कटर या मजबूत कैंची का उपयोग करें। अंतर्निहित मस्तिष्क के ऊतकों के विनाश को रोकने के लिए ब्लेड को यथासंभव सतही और कोण ऊपर की ओर रखें।
  4. रोंगूरों या मजबूत संदंश का उपयोग करके हड्डी को छील लें। बोनी श्रवण नहर को उजागर करते हुए, दोनों तरफ हड्डी को तोड़ने के लिए सेरिबैलम में टूल लेटरल डालें। मेनिंग्स के कनेक्शन तोड़ दें।
  5. धीरे-धीरे घुमावदार, ठीक टिप संदंश के साथ मस्तिष्क को उठाएं। मस्तिष्क को पन्नी के एक टुकड़े पर रखें और वजन रिकॉर्ड करें, और फिर तुरंत बर्फ पर संग्रहीत मीडिया की समान राशि (डब्ल्यू:वी) के साथ 15 मीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
    1. वैकल्पिक रूप से, यदि आवश्यक हो तो प्रत्यारोपण प्रक्रिया में अतिरिक्त उपयोग के लिए पिट्यूटरी ग्रंथि (मस्तिष्क के नीचे स्थित) को हटाने के लिए ठीक-ठाक संदंश का उपयोग करें।
  6. ऊतक को बाधित करने के लिए एक यांत्रिक समरूपता का उपयोग करें। कम गति पर 10-15 एस के लिए मस्तिष्क को समरूप बनाना। मिश्रण को कम से कम 1 मिन के लिए बर्फ पर बैठने दें, और फिर फिर से समरूप करें। जब अंतिम मिश्रण बड़े टुकड़ों से मुक्त होता है तो समरूपता पर्याप्त होती है।
  7. 100 माइक्रोन फिल्टर से गुजरकर समरूप को छान लें। उपयोग (4 घंटे से कम) तक बर्फ पर छानने वाले रखें।

3. पाचन और स्तन ग्रंथि अर्क की प्रसंस्करण

  1. गल या गर्म अभिकर्मकों के रूप में संकेत दिया(तालिका 1)। ऑर्गनॉइड या मोनोस्फाइड कोशिकाओं को ठीक करने के लिए उचित चरणों का पालन करें।
  2. हर दाता जानवर(पूरक फ़ाइल 1)के लिए सीरम मुक्त पाचन मीडिया (कोलेजेनेज के बिना) के 10 mL तैयार करें ।
    नोट: उपयोग किए जाने वाले पाचन मीडिया की मात्रा को समूहित ऊतक को समायोजित करने के लिए समायोजित (ऊपर या नीचे पहुंचाया गया) किया जा सकता है, यदि लागू हो।
    1. ऑर्गेनॉइड के लिए 3.3 तक छोड़ दें।
    2. मोनोस्पेचड कोशिकाओं के लिए, सीरम-मुक्त कोलेजेनेस पाचन मीडिया के अलावा ताजा मोनोडिस्थ्रोशन मिश्रण और निष्क्रियता समाधान(पूरक फ़ाइल 2, पूरक फ़ाइल 3)तैयार करें। 3.3 कदम आगे बढ़ें।
  3. जब दानदाताओं से सभी स्तन ऊतक निकाले गए हैं और कीमा बनाया गया है, तो गर्म (या कमरे के तापमान) पाचन मीडिया(पूरक फ़ाइल 1)में कोलेजेनेज एंजाइम जोड़ें। उलटा कर मिलाएं।
  4. एक 20 μm फिल्टर के माध्यम से कोलेजन पाचन मीडिया पास। पाचन के लिए लेबल 50 मिलीआर ट्यूबमें फ़िल्टर किए गए मीडिया के 10 मिलील को वितरित करें।
  5. प्रत्येक नमूने के लिए एक नया 1,000 माइक्रोन पिपेट टिप का उपयोग करें और प्रत्येक 60 मिमी पकवान से कोलेजेनेस पाचन ट्यूब पर कीमा बनाया हुआ दाता ऊतक स्थानांतरित करें। 1,000 माइक्रोन टिप के अंत से 1 सेमी काट लें और उपयोग से पहले डिवाइस पर मैन्युअल रूप से रखें। धीरे-धीरे 1-2 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके कीमा बनाया हुआ ऊतक मिलाएं।
    नोट: यदि ऊतक हस्तांतरण के दौरान पिपेट करने के लिए मुश्किल है, ५० mL ट्यूब से कोलेजन पाचन मीडिया की एक छोटी राशि का उपयोग करें, और फिर इसे वापस स्थानांतरित ।
  6. नमूनों को एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में क्षैतिज स्थिति में रखें और नमूनों को 37 डिग्री सेल्सियस, 200-220 आरपीएम पर 1.5-2 घंटे पचाने की अनुमति दें।
    1. ऑर्गेनॉइड के लिए 3.7 तक छोड़ दें।
    2. मोनोस्पेल्ड कोशिकाओं के लिए पाचन के अंतिम 10 वर्ष के लिए मिश्रण में DNase I (0.2 μg/mL) जोड़ें। पहले की तरह इनक्यूबेट, जोरदार झटकों के साथ। 3.7 कदम आगे बढ़ें।
  7. जब ऊतक पूरी तरह से पचा जाता है, तो 1,200 x ग्राम (चित्रा 1डी)पर 10 मीटर के लिए ठंडे केंद्रीकरण (4 डिग्री सेल्सियस) का उपयोग करके निलंबन को गोली मार दें।
    नोट: कोशिकाओं की व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए हर कदम के बीच बर्फ पर ट्यूब रखें।
  8. सुनिश्चित करें कि एक गोली का गठन किया है, और फिर ध्यान से बंद supernatant और वसा परत डालना । ताजा DMEM/F12 मीडिया के 10 mL में गोली को धीरे से फिर से निलंबित करें ।
  9. संक्षेप में लगभग 10 एस के लिए 68 x ग्राम पर स्पिन करें। यदि कोशिकाओं का कोई स्पष्ट अलगाव नहीं है तो स्पिन की लंबाई (लेकिन गति नहीं) बढ़ सकती है। नेत्रहीन आगे बढ़ने से पहले गोली का निरीक्षण(चित्रा 1डी)।
  10. ध्यान से एक छोटी मात्रा के पीछे छोड़कर, अलौकिक को हटा दें। अगले चरण पर आगे बढ़ें, इस आधार पर कि ऑर्गेनॉइड या मोनोस्फाइड कोशिकाओं की आवश्यकता है या नहीं।
    नोट ट्यूब में मीडिया की एक छोटी मात्रा को छोड़ना महत्वपूर्ण है क्योंकि गोली बहुत ढीली होगी। वॉश स्टेप्स के जरिए मीडिया की अवशिष्ट मात्रा को पतला किया जाएगा।
    1. ऑर्गेनॉइड के लिए डीएमईएम/एफ12 मीडिया की एक और 10 mL वॉल्यूम जोड़ें और वॉश/स्पिन को दोहराएं । दूसरे धोने के बाद, निस्पंदन के लिए DMEM/F12 मीडिया की एक छोटी मात्रा (1-2 mL) में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें । 3.11 कदम आगे बढ़ें।
    2. मोनोस्फेव्ड कोशिकाओं के लिए, 0.025% (w/v) ट्राइप्सिन और 6.8 मीटर ईटीए के साथ पूर्व-गर्म एचबीएसएसएस के 2 मिलीएल में भंग करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिन के लिए डाइजेस्ट। तुरंत निष्क्रिय करें।
      1. ट्राइप्सिन को निष्क्रिय करने से रोकने के लिए 10% एफबीएस के साथ डीएमईएम/एफ12 के 4 एमएल जोड़ें ।
      2. 5 मिन के लिए २७० x ग्राम पर कोशिकाओं स्पिन, और फिर DMEM में फिर से निलंबित/ कोशिकाओं को फ़िल्टर करने के लिए 3.11 कदम आगे बढ़ें।
  11. एक नया 50 मीटर ट्यूब में रखा एक 40 माइक्रोन सेल छलनी का उपयोग कर कोशिकाओं को फ़िल्टर करें। कोशिकाओं को निलंबित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही आधार माध्यम के 1 mL को पाइपिंग करके छलनी को प्री-वेट करें, और फिर डक्टल टुकड़ों/ऑर्गेनॉइड को इकट्ठा करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करके फिल्टर के माध्यम से सेल निलंबन पारित करें।
    नोट: एक एकल, 4 सप्ताह पुराने दाता चूहे के स्तन ग्रंथि ऊतक से फ़िल्टर एपिथेलियम की अनुमानित उपज 1 x 106 कोशिकाओं है ।
    1. ऑर्गेनॉइड के लिए, फिल्ट्रेट को छोड़ दें। मैमेरी ऑर्गेनॉइड सेल छलनी की टोकरी के अंदर रहेंगे और छोटी, अवांछित कोशिकाएं समाप्त हो जाएंगी। एक नया 50 mL ट्यूब पर सेल छलनी उलटा, और कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए आवश्यक किसी भी मात्रा के साथ कुल्ला। 3.12 कदम आगे बढ़ें।
    2. मोनोस्फाइड कोशिकाओं के लिए, सेल छलनी को त्यागें और फिल्ट्रेट रखें क्योंकि स्तन एपिथेलियल कोशिकाएं फिल्टर के माध्यम से गुजरेंगी, साथ ही छोटे स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ। 10% एफबीएस के साथ DMEM/F12 की एक और मात्रा के साथ पाचन/अपन्तिफेशन के लिए इस्तेमाल किया गया था कि ट्यूब कुल्ला और एक ही सेल छलनी के माध्यम से गुजरती हैं । 5 मिन के लिए 1,200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा मोनोस्पेग्ड कोशिकाओं को गोली मार ें। 3.12 कदम के लिए आगे बढ़ें।
      नोट: पुनर्निलंबित कोशिकाओं को बाद के अनुप्रयोगों के लिए तैयार हैं ।
  12. पल्स समाधान स्पिन और अगले कदम पर आगे बढ़ने से पहले एक सेल गोली के गठन सुनिश्चित करें। यदि आवश्यक हो तो पल्स फिर से स्पिन करें।
  13. अतिशयोक्ति को सावधानी से हटा दें। गिनती के लिए कोशिकाओं को ध्यान केंद्रित करने के लिए एक छोटी मात्रा (DMEM/F12 के 1,000-2,000 μL) में गोली को फिर से निलंबित करें ।
  14. कोशिकाओं की गणना करें और यदि आवश्यक हो तो पतला करें। प्रत्येक जानवर के लिए DMEM/F12 मीडिया के 20 μL में प्रत्यारोपण के लिए कोशिकाओं की वांछित संख्या को फिर से निलंबित करें । कोशिकाओं को हमेशा बर्फ पर रखें।
    नोट: दाता सेल 1 x 105 की सीमा में गिना जाता है-1 x १०६ कोशिकाओं को अध्ययन के अंतिम बिंदु के आधार पर प्रत्येक भ्रष्टाचार साइट के लिए आवश्यक हो जाएगा । उदाहरण के लिए, कार्सिनोजेनेसिस प्रयोगों के लिए अक्सर अन्य अनुप्रयोगों के सापेक्ष प्रत्यारोपित कोशिकाओं की अधिक संख्या की आवश्यकता होती है। आवश्यक कोशिकाओं की संख्या प्रयोगात्मक रूप से प्रत्येक तनाव के लिए निर्धारित की जानी चाहिए। इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रिया ने मस्तिष्क समरूप के साथ मिश्रण करने से पहले, मस्तिष्क होमोगेनेट के साथ मिश्रण करने से पहले, प्रति भ्रष्टाचार साइट 20 μL मीडिया में 250,000 दाता कोशिकाओं का उपयोग किया, जैसा कि चरण 3.16 में वर्णित है।
  15. अन्य प्रयोगों (जैसे, एफएसीएस आइसोलेशन3,26,27,30,33)के लिए आवश्यक कोशिकाओं के किसी भी एलिकोट (एस) को तैयार करें।
    1. ऑर्गेनॉइड के लिए, 3.16 कदम आगे बढ़ें।
    2. मोनोस्ट्राइव कोशिकाओं के लिए, ट्राइपैन या मेथिलीन नीले धुंधला का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की मात्रा निर्धारित करें, और फिर आगे बढ़ें।
  16. सभी प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के लिए दाता सामग्री के एकल बैचतैयार करें। प्रत्यारोपण की हर साइट के लिए 50% मस्तिष्क होमोजेनेट (20 माइक्रोन) के साथ सेल निलंबन (20 माइक्रोन) की बराबर मात्रा को मिलाएं।
    नोट: प्रत्येक साइट पर प्रति साइट कुल 40 माइक्रोन इंजेक्ट किए जाएंगे, लेकिन कचरे के लिए न्यूनतम 25% अतिरिक्त मात्रा शामिल करने की सिफारिश की जाती है।
  17. तुरंत प्रत्यारोपण के लिए आगे बढ़ना या बाद में प्रत्यारोपण के लिए कोशिकाओं फ्रीज (संभावित रोक बिंदु) ।
    नोट: जमे हुए कोशिकाओं को इस प्रोटोकॉल के साथ परीक्षण नहीं किया गया है और प्रत्यारोपण प्रयोगों के लिए जानवरों की एक पलटन पैदा करने के अग्रिम में अनुकूलन की आवश्यकता होगी । ताजा कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है।

4. प्रत्यारोपण प्रक्रिया (प्राप्तकर्ता चूहों 4-5 सप्ताह की उम्र)

  1. प्रत्येक प्राप्तकर्ता चूहे का वजन करें और प्रक्रिया में उपयोग की जाने वाली अनुमोदित एनाल्जेसिक की सही खुराक की गणना करें।
    नोट: शरीर के वजन प्रक्रिया के अग्रिम में 24 घंटे तक मापा जा सकता है । शेविंग की अवधि के लिए प्रत्येक जानवर को नियंत्रित करने या संक्षेप में एनेस्थेटिज़ करने के लिए संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करें।
  2. इलेक्ट्रिक क्लिपर्स का उपयोग करके प्रत्येक जानवर पर सर्जिकल क्षेत्र दाढ़ी। खोपड़ी के आधार की पहचान करें और कशेरुकी स्तंभ की शुरुआत करें। रीढ़ की हड्डी के नीचे लगभग एक तिहाई रास्ता, पीठ के ऊपरी छाती वाले हिस्से पर 3 सेमी x 2 सेमी क्षेत्र दाढ़ी।
    नोट: शेविंग भी प्रत्यारोपण के दिन संज्ञाहरण के तहत किया जा सकता है, लेकिन बाँझ क्षेत्र के बाहर प्रदर्शन किया जाना चाहिए । चूहे को अपने घर के पिंजरे में तब तक वापस करें जब तक कि इसकी आवश्यकता न हो।
  3. प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक सभी आपूर्ति का पता लगाएं(तालिका 1)।
  4. उपयोग से पहले प्रयोगशाला पशु संज्ञाहरण प्रणाली का मूल्यांकन करें। किसी भी तरल पदार्थ को बंद करें और आवश्यक किसी भी टैंक या भागों को बदलें। सुनिश्चित करें कि संज्ञाहरण कक्ष के लिए गैस लाइन खुली है और सभी परिधीय लाइनों को बंद कर दिया जाता है ताकि आइसोफ्लोरीन संज्ञाहरण और ऑक्सीजन को चैंबर में रखे जाने के बाद जानवर को स्वतंत्र रूप से प्रवाहित किया जा सके।
  5. प्राप्तकर्ता जानवरों के शरीर के तापमान का समर्थन करने के लिए गर्म हीटिंग पैड।
  6. बाँझ क्षेत्र है कि सर्जरी के लिए इस्तेमाल किया जाएगा उत्पन्न करें। टेबल 1में वर्णित आपूर्ति की व्यवस्था करें।
  7. प्राप्तकर्ता चूहों को प्रीऑपरेटिव एनाल्जेसिक का प्रशासन करें जैसा कि संस्थागत रूप से अनुमोदित पशु देखभाल प्रोटोकॉल द्वारा इंगित किया गया है।
  8. कोशिकाओं के नुकसान को रोकने के लिए बाँझ DMEM/F12 मीडिया के साथ हैमिल्टन सीरिंज फ्लश । सुनिश्चित करें कि सुई सिरिंज के शरीर के लिए सुरक्षित है, तरल में सुई डालें, और प्लंजर वापस खींचें। अधिकतम मात्रा में भरें। प्लंजर को नीचे दबाएं और सामग्री को अपशिष्ट संग्रह ट्यूब में निष्कासित करें। 3-5 बार दोहराएं।
  9. प्रत्येक स्थिति (जैसे, नियंत्रण, इलाज, वाइल्डटाइप, नॉकआउट, आदि) के लिए एक अलग सिरिंज में दाता सामग्री (चरण 3.16 में तैयार) की पूरी मात्रा लोड करें। सुई की नोक को तरल में डालें, प्लंजर को वापस खींचें और मिश्रण की सतह के नीचे सुई रखें क्योंकि ट्यूब में मात्रा कम हो जाती है।
    नोट: प्रत्येक सिरिंज में कम से कम 10% अतिरिक्त मात्रा शामिल करें। शेष मिश्रण को ट्यूब को बंद न करें और अधिक आवश्यकता होने की स्थिति में इसे बर्फ पर रखें।
  10. सिरिंज को पूरी तरह से लोड होने के बाद उलटा करें और सुई की नोक पर हवा के बुलबुले को हटाने के लिए प्लंजर को थोड़ा दबाएं। जब सब कुछ तैयार हो जाए तो अगले चरण पर आगे बढ़ें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि सुई की नोक किसी भी अन्य सतह को कभी नहीं छूती है, यहां तक कि बाँझ क्षेत्र के भीतर भी। कोशिकाओं की व्यवहार्यता को बढ़ावा देने के लिए बर्फ के एक छोटे से कंटेनर पर सिरिंज के शरीर को आराम करने के लिए यह मददगार है।
  11. प्राप्तकर्ता जानवर को संज्ञाहरण कक्ष में रखें और मशीन चालू करें।
  12. जब जानवर पूरी तरह से आराम करता है (कक्ष के दोहन या कोमल आंदोलन पर प्रतिक्रिया नहीं करता है), तो संज्ञाहरण को नाक शंकु में निर्देशित करें और जानवर को बाँझ क्षेत्र में स्थानांतरित करें।
    नोट: संज्ञाहरण की विस्तारित अवधि चूहों द्वारा अच्छी तरह से सहन नहीं की जाती है। प्रत्येक जानवर के लिए 10 मिन या उससे कम समय में प्रक्रिया पूरी करें।
  13. जानवर को प्रवण स्थिति (उसके पेट पर) में रखें ताकि सिर के पीछे और ऊपरी रीढ़ की हड्डी सुलभ हो।
    नोट: हर समय जानवर के लिए पर्याप्त गर्मी समर्थन सुनिश्चित करें और नियमित रूप से एक फर्म के अंगूठे चुटकी का उपयोग कर संज्ञाहरण की गहराई का आकलन ।
  14. वैकल्पिक रूप से, आंखों के सूखने को रोकने के लिए नेत्र पशु चिकित्सक मरहम लगाएं।
  15. अतिरिक्त बालों को हटाने के लिए हौसले से मुंडा क्षेत्र को साफ करें। एक परिपत्र गति का उपयोग करें और त्वचा के लिए 70% इथेनॉल (या किसी अन्य अभिकर्ता, प्रति संस्थागत दिशानिर्देश) लागू करें, जिसके बाद एंटीसेप्टिक (जैसे आयोडीन), और दोहराएं। जानवर पर एक तौलिया कपड़ा रखें ताकि केवल मुंडा क्षेत्र के लिए क्षेत्र उजागर हो।
  16. सुनिश्चित करें कि जानवर एक फर्म के अंगूठे चुटकी के साथ गहरी उत्तेजनाओं के लिए अनुत्तरदायी रहता है, और फिर अगले कदम के लिए आगे बढ़ना।
  17. एक तेज सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करके एक छोटा (2 सेमी) अंतरकपकार चीरा बनाएं।
    नोट: कटौती सतही होना चाहिए, क्योंकि वसा पैड त्वचा के ठीक नीचे स्थित है।
  18. अभिविन्यास के लिए मध्यरक्त वाहिका का पता लगाएं(चित्रा 2बी)।
  19. संदंश का उपयोग करचीरन के एक तरफ त्वचा लिफ्ट और यह वसा पैड से दूर पकड़ जबकि प्रत्यारोपण किया जाता है(चित्रा 2बी)। भ्रष्टाचार स्थल में सुई डालें।
    1. वैकल्पिक रूप से, ऊतक के अंदर सुई की नोक को स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक छोटी सी जेब बनाएं। एक छोटी, दोहराव वाली गति का उपयोग करें। सुई को न हटाएं।
      नोट: यह कदम प्रोटोकॉल के पहली बार उपयोगकर्ताओं के लिए अनुशंसित है। पॉकेट बनाते समय अत्यधिक सावधानी बरतें, क्योंकि इंटरस्केपुलर फैट पैड ऊतक बहुत नाजुक होता है।
  20. सावधानी से इंटरस्केपुलर फैट पैड ऊतक में सेल मिश्रण के 40 μL इंजेक्ट करें। सुई को धीरे-धीरे हटा दें।
  21. जगह में ऊतक पकड़ो और प्रत्यारोपित कोशिकाओं को 3-5 एस के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं । यदि आवश्यक हो तो संदंश की एक अतिरिक्त जोड़ी का उपयोग करें।
  22. सुई निकाल ें। प्रत्यारोपण की दूसरी साइट पर इंजेक्शन प्रक्रिया (चरण 4.18-4.21) दोहराएं।
    नोट: एक दाता समूह से epithelium हर जानवर में वसा पैड के एक ही पक्ष में इंजेक्शन दिया जा सकता है, या बारी पक्षों सर्जन के हाथ प्रभुत्व से बैच प्रभाव को रोकने के लिए ।
  23. घाव क्लिप या टांके का उपयोग कर सर्जिकल घाव बंद करो, और फिर संज्ञाहरण बंद कर दें।
  24. संस्थागत रूप से अनुमोदित प्रोटोकॉल द्वारा इंगित पोस्ट-ऑपरेटिव एनाल्जेसिक प्रदान करें।
  25. तुरंत गर्मी के समर्थन के साथ एक वसूली पिंजरे में जानवर ले जाएँ। चीरा या सांस लेने में परेशानी जैसे संकट के संकेतों के लिए मॉनिटर करें।
    नोट: जानवर को 5-10 मिनट के भीतर पूरी तरह से ठीक होना चाहिए। अस्तित्व प्रक्रियाओं के बाद जानवरों को कॉलोनी में लौटने और पोस्ट-ऑपरेटिव निगरानी के लिए संस्थागत दिशानिर्देशों का उल्लेख करें।
  26. वैकल्पिक रूप से, प्रत्यारोपण के 3-4 सप्ताह बाद प्राप्तकर्ता चूहों को कैंसरजन ों का प्रशासन करके भ्रष्टाचार स्थल (ओं) पर कार्सिनोजेनेसिस अध्ययन करें।
    नोट: आमतौर पर, चूहा मैममैरी कार्सिनोजेनेसिस 50-57 दिनों की उम्र में रासायनिक कार्सिनोजन उपचार का उपयोग किया जाता है। यह उपचार प्रत्यारोपण सर्जरी की उम्र तय करता है (जो 29-36 दिनों की उम्र के बीच किया जाना चाहिए) ग्राफ्ट की कोशिकाओं के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देने के लिए स्तन ग्रंथि के विकास शुरू करने के लिए ।

5. एपिथेलियल आउटग्रोथ का आकलन

  1. दैनिक योनि लावेज के माध्यम से चूहों के एस्ट्रस चक्र की निगरानी करें और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर साइटोलॉजी की जांच करें। अध्ययन के अंतिम बिंदु से 8-12 दिन पहले शुरू करें। सभी चूहों को एक ही अवस्था में कुर्बान कर दें। यह एक वैकल्पिक कदम है।
    नोट: चूहा एस्ट्रस चक्र 4-5 दिन है। जानवर को 1-2 पूर्ण चक्रों के माध्यम से जाने की अनुमति देने से व्याख्या की सुविधा होगी, क्योंकि पिछले चक्रों से लावेज स्लाइड का उपयोग तुलना के लिए किया जा सकता है।
  2. बलिदान प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता चूहों 6-8 सप्ताह प्रत्यारोपण के बाद, संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार ।
    नोट: आउटग्रोथ आमतौर पर प्रत्यारोपण के 3-6 सप्ताह बाद पता लगाने योग्य होता है, लेकिन अतिरिक्त समय की आवश्यकता हो सकती है।
  3. जानवर को प्रवण स्थिति में रखें और 70% इथेनॉल के साथ शरीर को साफ करें। त्वचा को संदंश के साथ उठाएं और इंटरस्केपुलर फैट पैड को बेनकाब करने के लिए कशेरुकी कॉलम के साथ एक चीरा बनाएं। त्वचा को ऊतक से दूर विच्छेदन करें ताकि अधिकांश वसा पैड दिखाई दे।
  4. मध्यरक्त वाहिका की पहचान करें जो इंटरस्केपुलर फैट पैड में भ्रष्टाचार साइटों को अलग करता है। पूरे पैड को ऊतक के एक टुकड़े के रूप में उत्पादित करें या रक्त वाहिका के साथ काट लें और पक्षों को व्यक्तिगत रूप से हटा दें।
  5. ऊतक को पूरे माउंट के लिए सकारात्मक रूप से चार्ज माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखें। कुंद संदंश के 2 जोड़े का प्रयोग करें और धीरे से ऊतक फैल स्लाइड पर अपनी मूल संरचना बहाल करने के लिए ।
    नोट: चूहा स्तन ऊतक बेहद नाजुक है। ऊतक के किनारों के नीचे ही कर्ल हो सकता है। हमेशा देखभाल के साथ संभालऔर जगह में पकड़ जब तक ऊतक स्लाइड (कुछ सेकंड) का पालन करता है ।
  6. तुलना के लिए पूरे माउंट एंडोजेनस पेट-इंगिनल मैममैरी ग्रंथियों (अभिविन्यास के लिए लिम्फ नोड्स के साथ) में से कम से कम एक।
  7. टिश्यू को डिफइन करने के लिए 7-10 दिनों के लिए 70% इथेनॉल में स्लाइड्स रखें। इथेनॉल की भरपाई के रूप में अक्सर के रूप में ऊतक बाहर सूखी नहीं है सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है ।
  8. फिटकरी-कारमाइन दाग तैयार करें और स्लाइड्स को प्रोसेस करें जब टिश्यू पर्याप्त रूप से अपारदर्शी हो। उपयोग(पूरक फ़ाइल 4)से पहले दाग को ठंडा करने की अनुमति दें।
    नोट: दाग निर्धारण और रिहाइड्रेशन कदम से पहले एक दिन तक तैयार किया जा सकता है । समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और पुन: उपयोग के लिए सीमित क्षमता है।
  9. स्लाइड्स में रखकर टिश्यू को ठीक करें 25% हिमनदों का एसिटिक एसिड- 60 मिन के लिए 75% इथेनॉल।
    1. इथेनॉल की घटती एकाग्रता की एक श्रृंखला में 3 वॉश की एक श्रृंखला के माध्यम से ऊतक को फिर से हाइड्रेट करें: 15 मिन के लिए 70% इथेनॉल, 5 मिन के लिए 50% इथेनॉल और 5 मिन के लिए डीएच2ओ।
  10. 4-8 दिनों के लिए फिटकरी कारमाइन के साथ दाग। प्रत्येक दिन स्लाइड के पीछे की जांच करें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि दाग पूरी तरह से ऊतक में प्रवेश कर गया है या नहीं। धुंधला पूरा हो गया है जब अगले कदम के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: धुंधला पूरा हो गया है जब ग्रंथि के सबसे मोटे भागों में बैंगनी रंग होता है और अब सफेद दिखाई नहीं देता है।
  11. इथेनॉल की बढ़ती एकाग्रता की एक श्रृंखला के माध्यम से स्लाइड स्थानांतरित करके ऊतकको डिस्टेन और निर्जलित करें: 30 मिन के लिए 70% इथेनॉल, 30 मिन के लिए 95% इथेनॉल और 30 मिन के लिए 100% इथेनॉल।
  12. ऊतक को साफ करने के लिए 3 + दिनों के लिए जाइलीन में निर्जलित स्लाइड रखें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए खनिज तेल में स्थानांतरित करें।
  13. स्लाइड्स साफ होने के बाद एनालिसिस के लिए स्लाइड्स की इमेज हासिल करने के लिए कम चलने वाली लाइट माइक्रोस्कोपी या हाई-रेजोल्यूशन वाली डिजिटल फोटोग्राफी का इस्तेमाल करें। सुनिश्चित करें कि छवि अधिग्रहण पैरामीटर सभी स्लाइड्स के लिए सुसंगत हैं।
    नोट: एपिथेलियल आउटग्रोथ स्पष्ट रूप से अलग होना चाहिए।
  14. एक बाइनरी परिणाम के रूप में वृद्धि की उपस्थिति का इलाज करें।
  15. अर्जित छवियों का उपयोग करके भ्रष्टाचार साइटों के 50% में 1 स्तन वृद्धि का उत्पादन करने वाली प्रत्यारोपित एपिथेलियल कोशिकाओं की औसत संख्या की गणना करें। आवश्यकतानुसार अन्य भौतिक विशेषताओं का परिमाणीकरण।

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Representative Results

दाता और प्राप्तकर्ता स्तन ग्रंथियों
प्रत्यारोपण के लिए चूहा स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं को अलग करने और तैयार करने के कदम चित्र 1एमें दिखाए गए हैं । उम्र के 4 सप्ताह में, दाता चूहे की एंडोजेनस मैमारी ग्रंथि परिपक्वता शुरू हो गई है और एपिथेलियम फिटकिरी कारमाइन(चित्र ा 1बी)के साथ दाग पूरे घुड़सवार स्लाइड पर कल्पना की जा सकती है। इस उम्र में एक दाता चूहा प्रत्यारोपण के लिए लगभग 1 x 106 कोशिकाओं प्रदान करेगा। यदि एकत्र किए गए दाता ऊतक या बाद में कीमा कीमा की मात्रा अपर्याप्त है, तो कोलेजेनेज पाचन के बाद कोशिकाओं की उपज कम हो सकती है। जैसे, दानदाताओं से जितना संभव हो उतना स्तन ग्रंथि ऊतक एकत्र करना महत्वपूर्ण है। पूरी तरह से पचा ने स्तन ग्रंथि ऊतक में एक तैलीय उपस्थिति होनी चाहिए, जिसमें निलंबन में ऊतक के कोई दृश्य टुकड़े नहीं होंगे(चित्रा 1सी)। एक ही दाता से स्तन ग्रंथि ऊतक के पूर्ण पाचन के परिणामस्वरूप एक दृश्यमान गोली का गठन होना चाहिए जिसमें स्तन ऑर्गेनॉइड होते हैं, जैसा कि(चित्रा 1डी)में दिखाया गया है। यदि कोई गोली दिखाई नहीं दे रही है, तो परख के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। चित्रा 2में, चूहा स्तन ग्रंथि और इंटरस्केपुलर फैट पैड स्थानदिखाए गए हैं। परिणामों की व्याख्या तब तक नहीं की जा सकती जब तक कि ऊतक संग्रह(चित्रा 2ए)और प्रत्यारोपण(चित्रा 2बी)के समय जैविक संदर्भ बिंदुओं की ठीक से पहचान न की जाए। इस परख में इंटरस्केपुलर वाइट फैट पैड के मध्यरक्त वाहिका का इस्तेमाल बायोलॉजिकल रेफरेंस प्वाइंट के तौर पर किया जाता है।

एपिथेलियल आउटग्रोथ का गुणात्मक और मात्रात्मक आकलन
प्रयोग की सफलता का निर्धारण करने के साथ-साथ प्रयोगात्मक चर ों से संबंधित प्रभावों की स्वायत्तता का मूल्यांकन किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध के लिए, कुछ अध्ययनों की तुलना के लिए मेजबान के एंडोजेनस पेट-इंगनियल मैममैरी ग्रंथि के साथ पूरे घुड़सवार स्लाइड की आवश्यकता हो सकती है। प्रारंभिक उपाय के रूप में, प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग बाइनरी परिणाम के रूप में एपिथेलियल आउटग्रोथ को दस्तावेज करने के लिए किया जा सकता है। इन आंकड़ों को सांख्यिकीय रूप से इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है कि भ्रष्टाचार अस्वीकृति दाता या प्राप्तकर्ता चर पर निर्भर है। एक पारस्परिक प्रत्यारोपण प्रयोग जहां इन कारकों में से प्रत्येक में 2 स्तर होते हैं- उदाहरण के लिए, वाइल्डटाइप (डब्ल्यूटी) बनाम नॉकआउट (KO), परिकल्पना परीक्षण(चित्रा 3ए)के लिए 4 प्रत्यारोपण समूह बनाएगा। प्रत्यारोपण समूहों, दाता के रूप में व्यक्त: प्राप्तकर्ता जीनोटाइप, कर रहे हैं: WT: WT, WT: KO, KO: KO, KO: WT । जब आइसोजेनिक या निकट-congenic जानवरों का उपयोग किया जाता है, तो भ्रष्टाचार अस्वीकृति मामूली होती है और प्रत्यारोपण समूहों में समान रूप से होती है। इंटरस्केपुलर फैट पैड के भीतर प्रत्यारोपण के लिए कई साइटों का एक लाभ प्राप्तकर्ता जानवरों की कमी की जरूरत है, क्योंकि 2 दाता सेल प्रकार एक ही मेजबान में मूल्यांकन किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, दोनों साइटों का उपयोग चूहों की एक ही संख्या का उपयोग करके एक उच्च घटना दर पर एक एकल दाता सेल प्रकार का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। एक उदाहरण के रूप में जीनोटाइप का उपयोग करना, यह चित्रा 3बीमें प्रदर्शित किया जाता है ।

पहले हासिल की गई स्लाइड्स की तस्वीरों का इस्तेमाल करके एपिथेलियल आउटग्रोथ का भी विश्लेषण किया जा सकता है । दोनों भ्रष्टाचार साइटों पर एपिथेलियल आउटग्रोथ युक्त एक पूरे घुड़सवार इंटरस्केपुलर फैट पैड का एक उदाहरण (सकारात्मक परिणाम के रूप में दर्ज) यहां वर्णित मैमैरी सेल प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल(चित्रा 3सी)का उपयोग करके एक प्रयोग के लिए दिखाया गया है। कई नमूनों में इंटरस्केपुलर फैट पैड में एपिथेलियम की कमी प्रक्रिया के साथ एक तकनीकी समस्या का संकेत हो सकता है और एक नकारात्मक परिणाम के रूप में माना जाता है ।

पारस्परिक प्रत्यारोपण प्रयोगों के परिणाम आगे प्रभाव है कि स्वायत्त या गैर-स्वायत्त mammary एपिथेलियल कोशिकाओं के लिए कर रहे है भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए कि एक प्रभाव मैममैरी एपिथेलियल कोशिकाओं (सेल-स्वायत्त) में प्रक्रियाओं से प्रेरित होता है या मेजबान/माइक्रोएनवायरमेंट (गैर-स्वायत्त) से प्रभावित होता है, दाता सेल फेनोटाइप के मेजबान (एंडोजेनस) फेनोटाइप को एक विरोधाभासी परिणाम के रूप में माना जाता है । कार्सिनोजेनेसिस परख जैसे उदाहरण में, ट्यूमर की घटना को बाइनरी रिस्पांस डेटा के रूप में विश्लेषण किया जा सकता है, और लॉजिस्टिक प्रतिगमन विश्लेषण यह निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है कि दाता, मेजबान या दाता-मेजबान बातचीत प्रत्यारोपण स्थल पर ट्यूमर घटना दर में महत्वपूर्ण योगदान देती है या नहीं। यदि प्रभाव दाता एपिथेलियम के गुणों से प्रेरित है, तो मेजबान की स्थिति पर ध्यान दिए बिना प्राप्तकर्ता समूहों में इसी तरह का प्रत्यारोपण परिणाम मनाया जा सकता है। यदि दाता एपिथेलियम विकसित होता है जैसे कि यह मेजबान के लिए एंडोजेन्सी थे, मेजबान के जीनोटाइप या उपचार के योगदान के कारण, प्रभाव गैर-स्वायत्त हो सकता है। दोनों स्थितियों में, प्रत्यारोपण समूहों जहां दाता एपिथेलियल कोशिकाओं मेजबान मिलान (स्वयं: स्वयं) नियंत्रण के रूप में व्याख्या की जानी चाहिए, और सांख्यिकीय विश्लेषण द्वारा समर्थित निष्कर्ष ।

प्रत्यारोपित एपिथेलियम पर स्वायत्त और गैर-स्वायत्त प्रभावों के परिणामों को प्रदर्शित करने के लिए, एक उदाहरण प्रदान किया गया है(चित्र4ए),जंगली प्रकार के पारस्परिक प्रत्यारोपण और Cdkn1b नॉकआउट रैटमैरी एपिथेलियम प्रयोगों से स्लाइड के साथ। इस अध्ययन के परिणाम गैर-स्तन सेल-स्वायत्त प्रभाव18 (चित्रा 4बी)का सुझाव दिया । पारस्परिक प्रत्यारोपण परिणामों के लिए एक बाइनरी प्रतिक्रिया के रूप में वर्गीकृत, परिणाम की संभावना (उदाहरण के लिए, एपिथेलियम की मेजबानी करने के लिए फेनोटाइप का सामंजस्य, या मात्रात्मक परख में सफल वृद्धि) स्पष्ट चर (जैसे, दाता या प्राप्तकर्ता जीनोटाइप) पर निर्भर किया जा रहा है मुख्य प्रभाव और बातचीत के संदर्भ के लिए एक रसद प्रतिगमन मॉडल के निर्माण से परीक्षण किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: दाता स्तन ग्रंथियों की तैयारी। (क)दाता जानवरों से स्तन ग्रंथि ऊतक निकालने और प्रत्यारोपण के लिए ऑर्गेनॉइड को ठीक करने की प्रक्रिया का अवलोकन । (ख)फिटकिरी कारमाइन धुंधला होने के बाद 4 सप्ताह पुराने चूहे (प्रत्यारोपण दाताओं की विशिष्ट आयु) की पूरी मुहिम के एंडोजेनस पेट-इंगिनल मैममैरी ग्रंथियां । 4 सप्ताह की उम्र में, स्तन एपिथेलियम विस्तार की प्रक्रिया में था, लेकिन डक्टल पेड़ पूरी तरह से वसा पैड में प्रवेश नहीं करता है, जैसा कि केंद्रीय लिम्फ नोड्स के निकटता का सबूत है। (ग)कीमा बनाया हुआ मैममैरी ग्रंथि की निरंतरता बर्फ पर एक ६० मिमी पकवान में काट (गुलाबी) के बाद दिखाया गया है, DMEM की एक उचित राशि के साथ/ आसन्न छवियां घोल को कोलेजेनेज पाचन मीडिया में स्थानांतरित करने के बाद कीमा बनाया हुआ एपिथेलियम की तुलना प्रदान करती हैं और जब पाचन पूरा हो जाता है, तो 90-120 मिनट बाद। (D)सेंट्रलाइज्ड के बाद पैलेट्ड एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड और लेयर सेपरेशन दिखाई देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: ऊतक संग्रह और स्तन एपिथेलियल सेल इंजेक्शन के लिए सीमाओं की पहचान। (ए)ऊतक संग्रह के लिए चूहा स्तन ग्रंथियों के स्थानों को दिखाया गया है। दानदाताओं और प्राप्तकर्ताओं से काटे गए एंडोजेनस पेट-इंगिनल मैममैरी ग्रंथियों का अनुमानित स्थान रेखांकित किया गया है । (ख)शेविंग और सतही चीरा लगाने के बाद, प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता के सफेद इंटरस्केपुलर फैट पैड उजागर हो जाते हैं । शीर्ष छवि: भूकंप के केंद्र में मध्यस्थ रक्त वाहिका (पीला तीर) दिखाई देती है। नीचे छवि: चीरा के एक तरफ त्वचा को त्वचा के नीचे वसा पैड की चौड़ाई दिखाने के लिए उठाया जाता है, जो मध्यस्थ रक्त वाहिका (पीला तीर) के सापेक्ष है। दाता एपिथेलियम वसा पैड में इस फ्लैप के नीचे इंजेक्शन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: पारस्परिक प्रत्यारोपण स्कीमा। (क)पारस्परिक प्रत्यारोपण के लिए विशिष्ट प्रयोगात्मक डिजाइन दिखाया गया है, एक उदाहरण के रूप में जीनोटाइप का उपयोग कर । वाइल्डटाइप (डब्ल्यूटी) दाता विशेषण के सापेक्ष जीन नॉकआउट (KO) जैसे एक प्रयोगात्मक चर का परीक्षण, 4 प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता समूह बनाता है। (ख)दाता सामग्री के 2 इंजेक्शन प्राप्त करने वाले एकल प्राप्तकर्ता पशु के लिए उदाहरण डिजाइन। मिडलाइन के साथ रक्त वाहिका की उपस्थिति के कारण इंटरस्केपुलर सफेद वसा पैड का उपयोग करते समय ग्राफ्टिंग के लिए कई साइटें सुलभ होती हैं। जंगली प्रकार और नॉकआउट दाता एपिथेलियम (या अन्य परीक्षण शर्तों) की अलग-अलग तैयारी को रक्त वाहिका के बाएं और दाईं ओर इंजेक्ट किया जा सकता है। (ग)प्रतिनिधि पूरे घुड़सवार एक प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता से वसा पैड ऊतक है एक ही अभिविन्यास में प्रदर्शित किया जाता है के रूप में उदाहरण में प्रस्तुत(बी)। ममेरी एपिथेलियल आउटग्रोथ फिटकिरी-कारमाइन दाग ऊतक के साथ एक पूरी मुहिम शुरू की स्लाइड पर प्रत्यारोपण के दो स्थलों पर दिखाई दे रहा है । इंटरस्केपुलर फैट पैड को प्रत्यारोपण के 6 सप्ताह बाद एक टुकड़ा के रूप में उत्पादित किया गया था। एपिथेलियल विकास के लिए अतिरिक्त समय की आवश्यकता हो सकती है लेकिन व्यक्तिगत दाता ग्राफ्ट को भेद करने में अधिक वृद्धि और कठिनाई की सुविधा भी हो सकती है। सामान्य जैविक कलाकृतियों दिखाई दे सकता है: एमएस = मांसपेशी, टीपी = प्रत्यारोपित एपिथेलियम, BF = भूरे रंग के वसा ऊतक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: मैमेरी सेल स्वायत्त और गैर स्वायत्त परिणाम विश्लेषण। (क)उन परिणामों का अनुकरण जो तब देखे जा सकते हैं जब दाता एपिथेलियम के फेनोटाइप पर स्वायत्त और गैर-स्वायत्त प्रभावों का महत्वपूर्ण योगदान हो । इस उदाहरण में, मेजबान से एंडोजेन्सल पेट-इंगिनल ग्रंथियों का उपयोग तुलना के रूप में किया जाता है। एंडोजेनस ग्रंथि की तुलना में दाता एपिथेलियल आउटग्रोथ के फेनोटाइप का सामंजस्य, संदर्भ के रूप में उपयोग किया जा सकता है, लेकिन विशेष रूप से प्रभाव निर्धारित करने के लिए उपयोग नहीं किया जाना चाहिए। (ख)एक पारस्परिक प्रत्यारोपण प्रयोग में सभी 4 समूहों के लिए एंडोजेनस ग्रंथि की छवियों से सटे प्रत्यारोपण स्थल पर दाता मैममैरी एपिथेलियम आउटग्रोथ दिखाई जाती है । एक जीन, Cdkn1bके नॉकआउट के बाद मनाया मैममैरी एपिथेलियम पर गैर-स्वायत्त प्रभाव, मेजबान के माइक्रोएनवायरमेंट का सुझाव विकासशील चूहा स्तन ग्रंथि18को प्रभावित करता है। स्केल बार 5 मिमी का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

कदम की जरूरत बर्फ पर आइटम गल/पूर्व गरम सर्जन के पास आइटम
1. मैममैरी ग्रंथि एपिथेलियम की तैयारी 60 मिमी पकवान बाँझ सर्जिकल उपकरण
DMEM/F12 के Aliquot 70% इथेनॉल
2. दाता मस्तिष्क निष्कर्षण 15 या 50 mL ट्यूब में मीडिया के Aliquot (लगभग 1-2 mL/दाता) वजन मस्तिष्क के लिए संतुलन, बाँझ क्षेत्र के भीतर
प्रत्येक दाता के लिए 15 मिलीग्राम ट्यूब लेबल, समरूपता के लिए उपयुक्त पन्नी
पिपेट और टिप्स (1000 माइक्रोन, या इलेक्ट्रॉनिक 5 mL सीरोलॉजिकल पिपेटके के साथ)
मैकेनिकल समरूपता
3. दाता ग्रंथियों का एंजाइमैटिक पाचन वॉश के लिए पर्याप्त DMEM/F12 सीरम मुक्त पाचन मीडिया लैब स्केल (जी)
DNAse I मोनोफैलाव मिश्रण इनक्यूबेटर/शेकर
निष्क्रियता समाधान प्रत्येक दाता के लिए 50 मिलीएल ट्यूब (लेबल)
बाँझ-फ़िल्टरिंग कोलेजेनेस डाइजेशन मीडिया के लिए 10 मिलील (या अधिक) सिरिंज
20-40 माइक्रोएम फिल्टर
पूर्व गीला फिल्टर करने के लिए मीडिया के Aliquot (s)
फ़िल्टर किए गए एंजाइम समाधान को एकत्र करने के लिए 50 मिलीएल ट्यूब (एस)
डिस्पोजेबल पाइपयुक्तों को काटने के लिए बाँझ कैंची
सुपरनेटेंट, या वैक्यूम लाइन को इकट्ठा करने के लिए बड़े बीकर को एस्पिरेटिंग के लिए
4. प्रत्यारोपण डोनर एपिथेलियम + ब्रेन होमोजेनेट मिश्रण हैमिल्टन सीरिंज-1 प्रति दाता जीनोटाइप/हालत
DMEM/F12 के अलीकोट प्राइम सीरिंज के लिए स्केल
बाँझ सर्जिकल आपूर्ति (स्केलपेल/कैंची, कई संदंश)
घाव क्लिप/टांके
धुंध
70% इथेनॉल या आइसोप्रोपेनॉल
बीटा-डाइन या आयोडीन
एनाल्जेसिक
प्राप्तकर्ता जानवरों के लिए हीट सपोर्ट
कागज तौलिए या नाजुक कार्य पोंछे

तालिका 1: प्रत्येक चरण में अग्रिम विचार की आवश्यकता वाली वस्तुएं। इस सूची को एक प्रयोग तैयार करते समय संदर्भ के रूप में उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है और इसे संपूर्ण नहीं माना जाना चाहिए। वैकल्पिक चरणों को शामिल करने/बहिष्कार के आधार पर प्रोटोकॉल के विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए अभिकर्मक केवल आवश्यक हो सकते हैं । किसी भी प्रयोग में, प्रक्रिया शुरू होने के बाद इन मदों को बिना किसी देरी के सुलभ होना चाहिए।

पूरक फ़ाइल 1: सीरम-फ्री कोलेजेनेज पाचन मीडिया तैयारी। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

पूरक फ़ाइल 2: मोनोफैलाव मिश्रण तैयारी। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

पूरक फ़ाइल 3: निष्क्रियता समाधान तैयारी। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

पूरक फ़ाइल 4: फिटकरी-कारमाइन दाग तैयारी। कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहां क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें)।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल चूहों के साथ काम करने के लिए अनुकूलित एक स्तन एपिथेलियल सेल प्रत्यारोपण तकनीक का वर्णन करता है। दाता चूहों (उम्र के 3-5 सप्ताह) से अलग-थलग स्तन एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड प्राप्तकर्ता चूहों के इंटरस्केपुलर सफेद वसा पैड (उम्र के 3-5 सप्ताह) में ग्राफ्ट किए जाते हैं। परिणाम के रूप में छोटे रूप में 4-6 सप्ताह बाद व्याख्या की जा सकती है, प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए ग्राफ्ट ऊतक की जांच; हालांकि, प्रत्यारोपण और बलिदान के बीच समय की इष्टतम राशि एक पूर्ण प्रयोग को लागू करने से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए । यदि बहुत कम या बहुत अधिक समय बीत चुका है, तो परिणाम न तो व्याख्या योग्य होंगे और न ही सार्थक । प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए, प्रत्यारोपण के 6-8 सप्ताह बाद जानवरों के एक छोटे सेट में वृद्धि का विश्लेषण करें। यदि प्रत्यारोपित एपिथेलियम मौजूद है, लेकिन अविकसित है, तो समय की लंबाई बढ़ाएं। यदि ग्राफ्ट अच्छी तरह से विकसित हैं, लेकिन एपिथेलियम की ओवरलैपिंग विशेषताएं विश्लेषणों में हस्तक्षेप करती हैं, तो एपिथेलियल आउटग्रोथ के लिए हफ्तों की संख्या को कम करने पर विचार करें। यदि समय की मात्रा को छोटा नहीं किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, कार्सिनोजेनेसिस प्रयोगों में), तो दोनों प्रत्यारोपण साइटों (मध्यस्थ रक्त वाहिका के प्रत्येक पक्ष पर एक) में एक ही प्रकार के दाता एपिथेलियम इंजेक्ट करने की सलाह दी जाती है, क्योंकि परिणामों को व्यक्तिगत से व्याख्या नहीं की जा सकती है 100% निश्चितता के साथ पक्ष। यदि किसी भी प्रकार की बातचीत (निरंकुश, पैराक्रिन) पर संदेह है, तो दोनों प्रत्यारोपण स्थलों में एक ही प्रकार के दाता एपिथेलियम के साथ इंजेक्शन वाले अतिरिक्त नियंत्रण जानवरों को शामिल करने की दृढ़ता से सलाह दी जाती है। प्रक्रिया में महत्वपूर्ण चरणों में एंजाइमैटिक पाचन के बाद दाता कोशिकाओं का उचित मात्राकरण, और मस्तिष्क समरूप के साथ समान मिश्रण शामिल है। इन कदमों पर अतिरिक्त सावधानी बरती जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रत्यारोपित कोशिकाओं की संख्या प्राप्तकर्ता जानवरों में सुसंगत है । इसके अलावा, इंजेक्शन के दौरान, सुनिश्चित करें कि ग्राफ्ट किए गए ऊतक मिश्रण इंटरस्केपुलर फैट पैड से लीक नहीं हो रहा है। 3. प्रयोग के अंत बिंदु पर इंटरस्केपुलर फैट पैड को उत्तेजित करना। पूरे पैड को एक टुकड़े के रूप में हटाया जा सकता है, लेकिन ध्यान रखा जाना चाहिए यदि इंटरस्केपुलर फैट पैड के 2 पक्षों को अलग करने का चयन किया जाए, तो मध्यरक्त वाहिका की पहचान करने के बाद ही काटना। यह पक्ष है जहां से वृद्धि की उत्पत्ति का निर्धारण करने के लिए मुश्किल हो सकता है, खासकर जब एक भ्रष्टाचार दूसरे में उग आया है, एक टुकड़ा और अधिक आदर्श के रूप में हटाने बना ।

प्रक्रिया का एक सामान्य संशोधन प्राप्तकर्ता चूहा25,29के कैंसरजनक उपचार को जोड़ना है । ग्राफ्ट किए गए ऊतक कार्सिनोजेनेसिस के प्रति संवेदनशीलता बनाए रख सकते हैं जो दाता चूहे25के पास था, या इसके विपरीत, दाता ऊतक मेजबान30की संवेदनशीलता को अपना सकता है। इन प्रभावों को केवल प्रत्यारोपण की साइट के रूप में इंटरस्केपुलर फैट पैड का उपयोग करते समय निर्धारित किया जा सकता है, क्योंकि अंतर्जात स्तन ग्रंथियां बरकरार रहती हैं और सकारात्मक, आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य करती हैं।

प्रत्यारोपण के लिए स्तन ग्रंथि ऑर्गेनॉइड का उपयोग करते समय, एपिथेलियल आउटग्रोथ की अनुपस्थिति दाता सेल तैयार करने या इंजेक्शन प्रक्रिया के साथ समस्याओं के कारण हो सकती है। भ्रष्टाचार अस्वीकृति भी तब हो सकती है जब प्राप्तकर्ता और दाता तनाव कॉन्जेनिक नहीं होते हैं, जिससे मेजबान में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया होती है। ऐसे मामलों में, प्राप्तकर्ता प्रतिरक्षा प्रणाली दाता ऊतक को गैर-स्व के रूप में पहचानती है, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शुरू करती है, और ग्राफ्ट किए गए ऊतक बढ़ने में विफल रहता है। भ्रष्टाचार की विफलता के जोखिम को कम करने के लिए जब दाता और प्राप्तकर्ता विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर हैं, न्यूनतम 6, और, आदर्श रूप में, परिणाम व्याख्या को प्रभावित करने वाली चुनौतियों को रोकने के लिए बैकक्रॉसिंग की 10 से अधिक पीढ़ियों की सिफारिश की जाती है। 6 बैकक्रॉस पीढ़ियों में, ज्यादातर कलम बाहर हो जाना होगा, लेकिन एक अल्पसंख्यक अभी भी असफल हो सकता है । जब भ्रष्टाचार की विफलता के कारण के रूप में परेशानी दाता सेल तैयारी, विचार है कि क्या एंजाइमैटिक पाचन भी कठोर था, कोशिकाओं को बहुत अधिक या तापमान के बहुत कम पर रखा गया था, संदूषण के स्रोतों, दाता सेल परख के लिए इस्तेमाल की संख्या के अनुकूलन , या अन्य प्रोटोकॉल विचलन सेल व्यवहार्यता और वृद्धि को प्रभावित करते हैं।

माउस में एकल मैममैरी स्टेम सेल दिखाए गए हैं ताकि एक कार्यात्मक स्तन ग्रंथि का पुनर्गठन करने में सक्षम हो, यह दर्शाता है कि प्राथमिक परिणाम के लिए हार्मोनल समर्थन का जोड़ आवश्यक नहीं है। मस्तिष्क समरूपता के अलावा दाता कोशिकाओं के लिए एक संरचनात्मक मैट्रिक्स के रूप में सेवा करके और माइग्रेशन प्रत्यारोपण अस्वीकृति3, 34,35,36के जोखिम को कम करके प्रत्यारोपण के परिणाम में काफी सुधार होता है । जब मस्तिष्क समरूप के साथ संयुक्त, प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं की न्यूनतम संख्या 10 गुना से अधिक कम हो जाती है, जबकि विकल्प3की तुलना में । महत्वपूर्ण बात, सिंजेनिक मस्तिष्क समरूप के मिश्रण को प्रत्यारोपित एपिथेलियम के फेनोटाइप को प्रभावित करने के लिए नहीं दिखाया गया है, और 40 से अधिक वर्षों के लिए मैमरी कार्सिनोजेनेसिस और संवेदनशीलता अध्ययन में लगातार परिणाम पैदा किया है।

कुछ लोग तर्क दे सकते हैं कि इंटरस्केपुलर फैट पैड शारीरिक भेद ों के कारण अंतर्जात मैममैरी फैट पैड का प्रतिनिधि नहीं है: भूरे रंग के वसा ऊतक के लिए वसा पैड की निकटता, रक्त वाहिका घनत्व में संभावित अंतर हार्मोन के संपर्क में अंतर या इंगिनल-पेट वसा पैड में प्रमुख लिम्फ नोड्स की उपस्थिति, जो साइटोकिन के विभिन्न स्तरों के लिए एपिलियम को बेनकाब कर सकती है। यद्यपि चूहों में इसका विशेष रूप से परीक्षण नहीं किया गया है, लेकिन ये दोनों डिपो चमड़े के नीचे हैं और आंत के37,38से पहले विकसित होते हैं ; मानव आदिमुद्रा में, अधिक से अधिक आणविक मतभेद आदिपोज क्षेत्रों में मौजूद हैं, और समूहों के भीतर विषमता पूरी तरह से38,39समझ में नहीं आता है . विचार करने के लिए एक अतिरिक्त कारक यह है कि सफेद इंटरस्केपुलर और मैममैरी फैट पैड Myf5+ मेसेंचिमल अग्रदूत वंश साझा करते हैं, लेकिन उस जनसंख्या40से प्राप्त कोशिकाओं की संख्या में भिन्न होते हैं। इसके बावजूद, सफेद इंटरस्केपुलर फैट पैड कम स्तन ग्रंथि के समान एक माइक्रोएनवायरमेंट प्रदान करता है। मैमेरी एपिथेलियम अपने स्वयं के मेसेनचिम के साथ फिर से जोड़ते हुए एक विशिष्ट मैममैरी पैटर्न20विकसित करता है, एक प्रभाव जो कृंतक अध्ययनों में अच्छी तरह से दस्तावेज है और मानव एडीपोज ऊतक19,20,24,41,42में टिप्पणियों का समर्थन करता है। सबसे बड़ी बात यह है कि चूहों और चूहों दोनों में स्तन एपिथेलियल प्रत्यारोपण सफलता के प्राथमिक निर्धारक वसा पैड43,44के आकार और अखंडता हैं। इस तकनीक का उपयोग करने में, कई स्तन कैंसर संवेदनशीलता अध्ययनों ने साबित कर दिया है कि सफेद इंटरस्केपुलर फैट पैड18,30,45में प्रत्यारोपित होने पर कार्यात्मक स्तन ऊतक को प्रभावी और नियमित रूप से उत्पन्न किया जा सकता है।

उच्च अनुकूलता के कारण, एपिथेलियल आउटग्रोथ मैममैरी सेल-स्वायत्त और गैर-स्वायत्त कारकों के लिए उत्तरदायी है और उदाहरण के लिए, दूध के भेदभाव या कार्यात्मक स्राव को बढ़ावा देने के लिए प्राप्तकर्ता चूहों के हार्मोनल हेरफेर का जवाब देगा। ऑर्गेनॉइड के प्रत्यारोपण का उपयोग अक्सर उन कारकों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है जो स्तन ग्रंथि विकास और/या कार्सिनोजेनेसिस को प्रभावित करते हैं। परिणामों की मात्रात्मक व्याख्या को सुविधाजनक बनाने के लिए ऑर्गेनॉइड को एकल सेल निलंबन में और पचाया जा सकता है। जबकि इस पेपर में वर्णित विधि को स्तन ग्रंथि ऊतक के अक्षुण्ण वर्गों को भ्रष्टाचार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (जैसा कि आमतौर पर चूहों में किया जाता है), एंजाइमैटिक विच्छेदन चरण अधिक विस्तृत निष्कर्ष निकालने की अनुमति देते हैं। चूहे में एंडोजेनस मैमैरी फैट पैड को प्रीक्लियर करने के बाद से यह वर्तमान में चूहा मैमरए एपिथेलियम की ग्राफ्टिंग के लिए अनुमति देने वाली एकमात्र विधि है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को Hollings कैंसर सेंटर के कैंसर सेंटर समर्थन अनुदान P30 CA138313 स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों(https://www.nih.gov/)से पायलट अनुसंधान वित्तपोषण द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और दक्षिण कैरोलिना के मेडिकल विश्वविद्यालय में पैथोलॉजी & प्रयोगशाला चिकित्सा विभाग से धन । हम साक्षात्कार बयानों की रिकॉर्डिंग के लिए Marijne स्मिथ का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µM syringe filters Fisher Scientific 09-715G sterile-filtering collagenase digestion media
1.5 - 2.0 mL microcentrifuge tubes (sterile) Fisher Scientific 05-408-129 containing resuspended cells and/or brain homogenate mixture
100 µM cell strainers Corning 431752 filtering brain homogenate
100 uL gastight syringes with 25 gauge needles Hamilton 81001 & 90525 For injecting graft mixture into recipient animals (1 per donor genotype/condition)
1000 uL pipette tips + pipette - - transferring cells/mixtures/tissue
15 mL polypropylene tube Falcon (Corning) 352196 brain homogenate mixture storage, or cell : homogenate mixture for transplantation
40 µM cell strainers Corning 431750 filtering organoids after washing the cell pellet
50 mL polypropylene tubes Fisher Scientific 05-539-6 for collagenase digestion of donor mammary gland tissue
60 mm dishes Thermo Scientific 130181 for mincing tissue
Alum Potassium Sulfate Sigma-Aldrich 243361/237086 staining mammary gland whole mount slides
Anesthesia vaporizer for veterinary use - - follow institutional protocol
Beta-dine or iodine - -
Borosilicate glass culture tube for homogenization Fisher Scientific 14-961-26 for homogenization of brain (use appropriate tube for homogenizer)
Carmine Sigma-Aldrich C6152/1022 staining mammary gland whole mount slides
Cell counting apparatus - -
Clean animal cages for recovery - - follow institutional protocol
Collagenase Type 3 Worthington Biochemical Corp. LS004183 enzymatic digestion of minced mammary gland tissue from donor rats
deionized water - - for chemical solutions
DMEM/F12 GIBCO 11320033 for mincing tissue, collagenase digestion media and resuspending epithelial cell mixtures
EDTA - - monodispersion mixture
Ethanol, 200 Proof Decon Labs 2705/2701 mammary whole mount slide fixative, mammary whole mount slide washes, cleaning surgical incision sites (diluted)
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone - inactivation solution
Gauze - -
Glacial acetic acid Fisher Scientific A38-212 use for mammary whole mount slide fixative (1:4 glacial acetic acid in 100% ethanol)
HBSS GIBCO - monodispersion mixture
Heating pads - - follow institutional protocol
Ice buckets (x2) - -
Incubator with orbital rotation - - must be capable of maintaining 37°C, shaking at 220-225 RPM (for collagenase digestion of mammary tissue)
Isoflurane anesthesia - - follow institutional protocol
Light microscope or digital camera - - visualizing whole mounted mammary epithelium and/or acquiring images
Mechanical homogenizer Fisher Scientific - TissueMiser or alternative models
Mineral oil, pure Sigma-Aldrich/ ACROS Organics 8042-47-5 long-term storage of cleared mammary gland whole mounts
Oxygen tanks for anesthesia vaporizer - - follow institutional protocol
Paper towels or delicate task wipes - -
Positively-charged microscope slides Thermo Scientific P4981-001 mammary gland tissue whole mounts
Postoperative analgesic - - Institutional protocol
Scale body weight measurements of animals, proper dosing of pain medication
Shaver - - electric clippers, or other
Staining jars - - minimum of 1 per chemical wash, size appropriate for the number of slides, glass preferred
Sterile field drapes IMCO 4410-IMC used during transplantation
Sterile scissors and forceps x3 (autoclaved) - - autoclave surgical tools used for donors and recipients
Syringes: 5 mL (or greater) - - for sterile filtration of collagenase digestion media
Trypsin Worthington monodispersion mixture
Waste collection receptacle for liquids (poured or aspirated) - -
Wound clip applier, clips, and removal tool Fine Science Tools 12020-00 Closing the skin incision over the interscapular white pad pad
Xylenes Fisher Scientific X3S-4 clearing mammary gland whole mount slides after staining

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References

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इंटरस्केपुलर व्हाइट फैट पैड में चूहा मैमेरी एपिथेलियल सेल प्रत्यारोपण
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