Summary
이 원고는 복부 대동맥류의 마우스 모델에 발광 직경, 펄스 전파 속도, dtensibility 및 방사형 변형을 측정하기 위해 고주파 초음파 이미징을 사용하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
복부 대동맥류 (AAA)는 원래 크기의 1.5 배까지 최대 내발 경도 (MILD)를 초과하는 복부 대동맥의 국부적 인 팽창으로 정의됩니다. 임상 및 실험 연구는 작은 동맥류가 파열 될 수 있음을 보여 주었다, 큰 동맥류의 하위 인구는 안정적으로 남아있을 수 있지만. 따라서, 대공의 내발경 측정 외에도, 용기 벽의 구조적 특성에 대한 지식은 AAA의 안정성을 평가하는 중요한 정보를 제공할 수 있다. 대동맥 경화는 최근 혈관 벽의 초기 변화를 결정하는 신뢰할 수있는 도구로 부상했습니다. 맥박 전파 속도(PPV)와 방사형 스트레인은 대동맥 강성을 평가하는 데 매우 유용한 초음파 기반 방법입니다. 이 프로토콜의 주요 목적은 온화한, PPV, 분산성 및 방사형 변형에 의해 결정된 대로 대류의 구조적 및 기능적 특성을 분석하고 이미지를 획득하고 분석하기 위해 초음파 이미징 시스템을 사용하는 포괄적 인 기술을 제공하는 것입니다.
Introduction
복부 대동맥류(AAA)는 원래 혈관 직경을 1.5배 인 대동맥의 영구적인 국부화 팽창을 특징으로 하는 중요한심혈관 질환을 나타낸다. AAA는 미국에서 사망의 상위 13 원인 중 순위2. AAA의 진행은 대동맥 벽과 엘라스틴 단편화의 변성에 기인하며 궁극적으로 대동맥 파열로 이어집니다. 대동맥벽의 이러한 변화는 최대 내발경(MILD)의 유의한 증가 없이 발생할 수 있으며, 따라서 MILD 만으로는 질병의 중증도를 예측하기에 충분하지 않다는 것을 시사한다3. 따라서 대동맥 벽의 초기 변화를 감지하기 위해 추가 요인을 식별해야하며, 이는 조기 치료 옵션을 안내 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 펄스 전파 속도 (PPV), 감도 및 방사형 변형의 측정을 특징으로초음파 이미징을 사용하여 대동맥 기능 적 특성을 평가하기위한 실용적인 가이드를 제공하는 것입니다.
AAA를 연구하는 잘 특징지어진 실험 모형은, 먼저 Daugherty와 동료에 의해 기술된, Apoe-/- 마우스4에있는 삼투성 펌프를 통해 안지오텐신 II (AngII)의 피하 주입을 관련시킵니다. 초음파 화상 진찰을 사용하여 온화한의 정밀한 측정은 이 마우스 모형5에서AAA를 특성화하는 중요한 역할을 했습니다. AAA의 발달 도중 조직학 변경은 광범위하게 연구되었더라도, 대동맥 강성과 같은 혈관 벽의 기능적 특성의 변경은 잘 특성화되지 않았습니다. 이 프로토콜은 AAA의 시간적 진행을 연구하기위한 강력한 도구로 정교한 분석과 함께 고주파 초음파의 사용을 강조합니다. 특히, 이러한 접근법을 통해 PPV, 도면및 방사형 변형으로 측정된 용기 벽의 기능적 특성을 평가할 수 있습니다.
AAA를 가진 인간 피험자에서 최근 임상 연구는, 뿐만 아니라 뮤린 엘라스타제 유도 AAA 모델에서, 대동맥 경직과 대동맥 직경 사이의 양성 상관관계를 시사한다6,7. PPV, 대동맥 강성의 지표는, 용기 벽6,8의강성의 변화를 정량화하기위한 우수한 측정으로 받아 들여진다. PPV는 혈관을 따라 두 부위에서 펄스 파형의 이동 시간을 측정하여 계산되므로 대동맥 강성의 지역적 평가를 제공합니다. 우리는 최근에 PPV에 의해 측정된 바와 같이 대동맥 강성이 증가하고, 원자력 현미경을 사용하여 결정된 세포 수준에서, 동맥류 발달9와긍정적으로 상관관계가 있음을 입증했습니다. 또한, 문헌은 대동맥 강성이 동맥류 팽창을 선행할 수 있으며 따라서 AAA10의개발 동안 선박 벽의 지역 내재 특성에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있음을 시사한다. 마찬가지로, 분력 및 변형률 측정은 동맥 적합성의 초기 변화를 측정하는 정량화 도구입니다. 건강한 동맥은 유연하고 탄력있는 반면, 강성이 증가하고 탄력이 적어지므로 탄력과 변형이 감소합니다. 여기서, 우리는 마우스에서 MILD, PPV, 분산성 및 방사형 변형을 측정하는 고주파 초음파 시스템의 사용을 위한 실용적인 가이드 및 단계별 프로토콜을 제공한다. 프로토콜은 특정 초음파 이미징 기기 및 첨부 된 비디오 자습서에 대한 매뉴얼에서 제공하는 기본 정보와 함께 사용되어야하는 기술적 인 접근 법을 제공합니다. 중요한 것은, 우리의 손에 설명된 화상 진찰 프로토콜은 실험적인 AAA의 발달 그리고 진행의 연구 결과에서 귀중한 것처럼 보이는 재현가능하고 정확한 데이터를 제공합니다.
초음파 화상 진찰의 유용성을 더 설명하기 위하여는, 우리는 실험적인 AAA11를방지하기 위한 약리학 적인 접근을 이용하기 위한 우리의 자신의 연구 결과에서 취한 보기 심상 그리고 측정을 제공합니다. 구체적으로, 노치 시그널링은 혈관 발달 및염증(12)의다중 양상에 관여하는 것으로 제안되었다. 유전자 haploinsufficiency 및 약리학 적인 접근을 사용하여, 우리는 이전에 노치 억제가 혈관 상해의 사이트에 대식세포의 침투를 방지해서 마우스에 있는 AAA의 발달을 감소시킨다는 것을 입증했습니다13,14,15. 현재 기사에서는 노치 억제를 위한 약리학적 접근법을 사용하여 AAA와 관련된 대동맥 강성과 요인 사이의 관계에 초점을 맞춥니다. 이 연구 결과는 노치 억제가 AAA 진행의 척도인 대동맥 강성을 감소시킨다는 것을 보여줍니다11.
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Protocol
마우스와 초음파 화상 진찰의 취급을 위한 프로토콜은 미주리 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (동물 프로토콜 번호 8799)에 의해 승인되고 AAALAC 국제에 따라 실시되었습니다.
1. 쥐의 장비 설치 및 준비
- 장비 설정
- 초음파 기기, 초음파 젤 워머 및 가열 패드를 켭니다.
- 초음파 프로그램을 열고 각 마우스에 대한 연구 이름과 설명 정보를 입력합니다.
- 응용 프로그램을 일반 이미징으로선택합니다.
- 복부 이미징에 적합한 트랜스듀서를 선택합니다(그림1B,C). 이 실험에서는 MS400 트랜스듀서가 사용됩니다.
- 마취 이소플루란과 산소 수준이 각 실험 세션에 적합한지 확인하십시오.
- 초음파 동물 이미징 플랫폼을 청소하십시오.
- 마우스 준비
- 가열 패드(36.5 ~ 38.5°C)의 상단에 마우스 케이지를 놓습니다.
- 마우스를 꼬리 밑면으로 가볍게 잡고 산소가 채워진 이소플루란 챔버에 놓습니다.
- 이소플루란과 산소 흐름을 유도 챔버로 직접 지시합니다.
- 이소플루란 기화기를 켜고 이소플루란 레벨을 1-2% vol/vol로 설정합니다.
- ~ 2 분 후, 마우스의 발 패드를 꼬집어 때 철수 반사의 부재에 의해 마취의 적절한 깊이를 확인합니다.
- 다음으로, 유도 챔버 공급 지점을 끄고 마취 코 콘으로 향하는 가지를 켭니다.
- 유도 챔버에서 초음파 이미징 단계로 마우스를 옮기고 마취 콘을 동물의 코 위에 놓습니다.
- 최적의 스캔을 위해 동물 이미징 플랫폼을 오른쪽 아래 모서리로 10° 정도 기울이면됩니다(그림 1B).
- 마취하에 건조를 방지하기 위해 마우스의 두 눈에 멸균 안과 용액 한 방울을 넣습니다.
- 코를 마취 콘에 삽입하여 마우스를 척추 위치에 놓습니다.
- 전극 겔을 면봉을 사용하여 네 발 모두에 적용하고 심전도 판독을 위한 동물 이미징 플랫폼에서 구리 리드에 발을 테이프로 붙입니다(그림1C).
- 클리퍼를 사용하여 이미징 부위에서 모발을 면도한 다음 제모 크림을 바르서 남은 털을 제거합니다. 1분 이내에 그대로 둡니다.
- 젖은 종이 타월로 크림과 머리카락을 부드럽게 닦아냅니다.
- 호흡을 모니터링하고 심박수가 450-550 비트 /분 사이에 유지되도록하십시오. 이 수준 이하인 경우, 이소플루란 흐름을 줄이고 심박수가 회복될 때까지 기다립니다.
- 미리 따뜻한 초음파 젤 (37 °C)을 준비된 피부 부위에 바르고 트랜스듀서를 홀더에 부착하고 젤에 닿을 때까지 아래로 낮춥니다(그림 1C).
2. 복부 대인의 초음파 화상 진찰
- 트랜스듀서를 수평으로 배치합니다(즉, 마우스의 중간선에 수직).
- 초음파 젤을 부드럽게하고 면봉의 나무 막대기를 사용하여 거품을 제거합니다.
- 트랜스듀서를 내리고 겔을 만진 후 다이어프램 아래에 0.5-1 cm를 놓습니다. 이제 이미지를 관찰하기 시작합니다.
- 짧은 축 뷰에서 복부 대강을 시각화합니다(그림1C).
참고: B 모드는 해부학적으로 대류를 찾고 트랜스듀서를 배치하는 기본 및 가장 효과적인 모드입니다. 복부 대동맥은 짧은 축에서 색상 도플러 및 파워 도플러 모드를 사용하여 맥동 유량의 존재에 의해 확인된다 (즉, 대동맥의 원주 단면). 동물 스테이지와 트랜스듀서의 미세 조작기를 조정하여 대동맥의 단면을 이미지 중앙으로 가져옵니다. - 트랜스듀서를 시계 방향으로 90° 부드럽게 회전하고 x축 마이크로 매니퓰레이터 노브를 천천히 조정하여 대동맥을 긴 축 뷰(대동맥의 세로 부분)에서 시각화합니다.
참고: 대부분의 경우 위장관 가스는 이미지를 방해할 수 있으며 대하는 대관이 선명한 장거리 축 시야를 허용하기 위해 최적의 각도에 있지 않을 수 있습니다. 허용되는 긴 축 뷰가 얻을 때까지 트랜스듀서의 각도를 천천히 그리고 수평으로 조정합니다. 문제가 지속되면 트랜스듀서를 높이고 트랜스듀서 아래의 기포를 확인하고 동물 단계의 기울기 각도를 약간 조정하고 젤을 다시 적용한 다음 모든 단계를 다시 반복합니다. - 포커스 영역과 초점 깊이 토글을 사용하여 대불 영역에서 초점 영역과 깊이를 각각 설정합니다. 대강벽의 최적의 대비를 달성하기 위해 대강물의 내강을 어둡게 하기 위해 시간 이득 보정 슬라이더를 수동으로 조정합니다.
- y축 조작기를 조정하여 우수한 장간막과 오른쪽 신장 동맥의 분기 점을 시각화합니다. 오른쪽 신장 동맥을 랜드마크로 사용하여 대동맥의 이미지를 캡처합니다(그림2A).
- 수월 대장에서 B 모드 이미지의 최소 100프레임을 기록합니다.
- Cinestore를 눌러 B 모드 이미지를 저장합니다.
- 악기 키보드의 M 모드 버튼을 눌러 M 모드 레코딩을 활성화합니다. 커서 볼을 굴려 노란색 표시선을 선명한 용기 벽 이미지가 있는 일반 대동맥 섹션또는 동맥류의 최대 직경이 관찰되는 섹션으로 가져옵니다.
- SV/게이트 토글을 누르고 커서 볼을 조정하여 용기 벽이 측정 브래킷에 포함되도록 합니다. 업데이트를 눌러 M 모드 측정을 기록하고 cinestore를 눌러 캡처합니다(그림2A, B).
참고: 동맥류의 최대 직경은 대동맥의 최적의 장거리 보기와 동일한 이미징 평면에 없을 수 있습니다. 각 M 모드 측정에 대해 x축 조작기 노브를 약간 조정하여 각 섹션의 MILD가 캡처되도록 합니다. - ECG 게이트 킬로헤르츠 시각화(EKV) 이미지를 얻으려면 B 모드 버튼을 눌러 B 모드 레코딩으로 돌아갑니다.
참고: 이미지가 선명하지 않은 경우 x축 조작기를 조정하여 단면 길이(예: > 6mm)에 걸쳐 루멘의 상부 벽의 가장 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. - 키보드의 물리 설정 버튼을 누르고 호흡 게이팅을선택합니다. 게이팅 지연 및 창을 수동으로 조정하여 호흡파의 평평한 부분 동안에만 데이터를 기록합니다. 기록 섹션은 호흡 파의 추적에 컬러 블록으로 표시됩니다.
참고: 호흡 게이팅을 조정하지 않으면 호흡 중 동물의 정상적인 움직임으로 인해 EKV 이미지가 흐려집니다. - EKV 버튼을 눌러 EKV 모드를 활성화합니다. 적절한 메뉴에서 표준 해상도 및 프레임 속도 3000 이상을선택합니다. EKV 이미지를기록하려면 진행을 선택합니다. cinestore를 눌러 이미지를 저장합니다. EKV 모드 이미지를 사용하여 펄스 전파 속도(PPV), 분산성 및 방사형 변형률을 측정합니다.
참고: 호흡에 비정상적인 변동이 있거나, 동물이 너무 빠르게 발신중이거나, 프레임 속도 설정이 너무 높으면 EKV 기록이 실패할 수 있습니다. 이 경우 프레임 속도를 낮게 설정하고 동물의 호흡이 안정될 때까지 기다립니다. 프레임 속도를 3000으로 설정하는 것은 일반적으로 마우스와 쥐 모두에 적합합니다.
3. 이미징 후 단계
- 따뜻한 물로 적시고 종이 타월로 마우스의 복부 부위에서 초음파 젤을 부드럽게 닦으십시오.
- 마우스를 홈 케이지에 다시 놓고 가열 패드에 놓습니다.
- 이소플루란 기계를 끄고 동물 이미징 플랫폼을 청소하고 젖은 물티슈로 트랜스듀서를 청소하십시오.
- 초음파 스캔 중에 수집된 이미지 데이터를 하드 드라이브로 전송합니다.
- 초음파 기기를 끕니다.
- 마우스가 마취에서 회복되고 경고가 나면 가열 패드를 제거하고 케이지를 동물 하우징 랙으로 되돌린다.
4. 복부 대동맥 이미지 분석
- MILD를 측정하는 M 모드 이미지 분석
- 초음파 프로그램을 열고 각 마우스에 대한 연구 이름과 설명 정보를 입력합니다.
- 분석 소프트웨어에서 초음파 데이터를 열고 M 모드 이미지를 열고 하트 비트를 일시 중지합니다.
- 측정값을 클릭합니다.
- 드롭다운 옵션에서 혈관 패키지를 선택합니다. 깊이를 클릭하고 내부 벽에서 벽으로 이어지는 대동맥 루멘을 가로질러 선을그립니다(그림 2C,D).
참고 : 일관성을 위해 대반이 최대로 확장 될 때 심장 주기의 수축기 단계에서 측정을 수행해야합니다. 세 개의 서로 다른 하트비트에 걸쳐 세 개의 선을 그려 서 MILD의 정확하고 평균적인 측정을 얻을 수 있습니다. AAA에서, 측정은 대물의 최대 팽창에서 취합니다. 또한 장 운동성의 간섭을 피하고 이미지 선명도를 보장하기 위해 이미지를 수집하기 전에 동물을 4-6 시간 빨리 하는 것이 좋습니다.
- 펄스 전파 속도 분석(PPV)
- EKV 이미지를 열고 하트비트를 일시 중지합니다.
- 이름 아이콘을 클릭하여 분석 소프트웨어(예: Vevo Vac)에서 새 창을 엽니다.
- PPV 옵션(그림 3D의화살표)을 클릭합니다. 대극장의 이미지와 함께 작은 창이 더 나타납니다.
- 상부 용기 벽을 클릭하고 포인터를 약 4mm 동안 드래그하여 사각형 상자를 그립니다.
참고: 모든 이미지에 대해 상자 길이를 일관되게 유지합니다(~4mm). 사용자는 상자를 정렬하고 라인을 선택한 다음 분석중인 용기의 새로운 위치로 드래그하여 펄스 파의 가장 적절하고 명확한 굴곡을 얻어 직사각형 상자를 조정할 수 있습니다. 사각형의 데이터 세로 선이 표시되고 ROI의 왼쪽(위쪽 이미지) 및 오른쪽(아래 이미지)으로 식별됩니다. 펄스파의 변곡점을 더 잘 시각화하기 위해 그림 3과같이 상부 벽에만 그리기 상자에 유용할 수 있습니다. 소프트웨어는 자동으로 PPV (m / s)를 계산합니다. 그러나 펄스 파에 정확한 변곡점을 설정하기 위해 보라색 선을 수동으로 조정하는 것이 좋으며 PPV는 그에 따라 변경됩니다. - 마지막으로 수락 명령을 선택하여 PPV 값을 저장합니다. 수치와 데이터를 데이터 저장소 드라이브로 내보냅니다.
- 분산성 및 방사형 변형에 대한 분석
- EKV 이미지를 열고 하트비트를 일시 중지합니다.
- 소프트웨어 아이콘을 클릭합니다. 소프트웨어가 새 창을 엽니다.
- 추적 새 ROI를 클릭하고 선박의 양쪽 벽에 직사각형 상자를 그립니다. 소프트웨어는 자동으로 선박의 상부 및 하부 벽을 추적합니다. 사용자는 녹색 점(그림 4A, B)을클릭하여 벽에 정렬하는 추적을 조정할 수 있습니다.
- 이제 추적을 수락합니다. 소프트웨어는 선택한 ROI에서 의 부전성(1/Mpa)을 계산합니다.
- 방사형 변형률 측정의 경우 왼쪽 상단의 메뉴 막대에서 적절한 변형 옵션을 선택합니다. 방사형 변형 및 접선 변형에 대한 이미지가 열립니다.
- 방사형 변형률(%) 값 얻기 커브의 피크에서 커서를 이동합니다. 데이터를 이미지 또는 비디오 형식으로 내보냅니다(그림4A, B).
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Representative Results
마우스로부터의 정상 및 동맥류 복부 대동맥의 대표적인 M모드 이미지는 각각 도 2A 및 도 2B에나타내고 있다. 상복부 대동맥은 오른쪽 신장 동맥 과 우수한 장간막 동맥 옆에 있는 그것의 위치에 의해 확인됩니다(그림 2A). 수축기 심장 주기의 세 가지 상이한 심장 박동에서, 정상 및 동맥류 대동맥의 계산에 사용되는 대표적인 이미지는 각각 도 2C,D에 나타내고 있다. 대동맥류가 발달한 상황에서, 발광 직경은 최대 팽창 의 영역에서 루멘의 두 안쪽 가장자리 사이에 수직 노란색 선을 그려서 결정된다(그림 2B). 정확한 내발 경도를 결정하기 위해 일반적으로 세 가지 독립적인 측정이 평균됩니다.
PPV 분석에 사용되는 복부 대회의 대표적인 EKV 이미지는 도 3에나타내고 있다. PPV는 대불의 발광벽에 직사각형 상자를 그리고(그림 3E)직사각형 상자로부터 얻어진 데이터의 보라색 수직 선의 조정에 의해 계산된다(그림3F). 펄스 파의 변곡점을 설정하도록 보라색 선을 조정해야 합니다. 도 4에도시된 바와 같이, 팽만도 및 방사형 균주 분석에 적합한 복부 대치의 대표적인 EKV 영상을 도시한다. 도 4E에나타난 바와 같이 불감도 및 방사형 변형은 상월 대류의 발광 벽을 추적하여 계산됩니다. 감쇠(1/MPa)의 값은 상자의 드롭다운 메뉴에서 [감도/탄력성] 옵션을 선택하여 얻을 수 있습니다(빨간색 화살표, 그림4F). 방사형 변형률(%) 방사형 변형 옵션(그림 4G)을선택하고 커서를 방사형 변형률 그래프의 피크로 이동하여 얻을 수있습니다(그림 4H).
우리는 AAA의 AngII 유도 마우스 모델에서 PPV의 중요성을 검증하고 노치 억제제의 치료 잠재력을 추가로 검사했습니다 (N-[N-(3,5-디플루오로페나세틸)-L-알라닐]-(S)-페닐글리신 t-부틸 에스테르; DAPT)는 사전 확립된 AAA의 진행 및 안정성에 관한 것이다. 구체적으로, 이러한 모든 동맥류 연구는 출판된 프로토콜4,13에의해 AngII의 주입 후 8-10주 된 아포에-/- 수컷 마우스에 대해 수행되었다. AngII 주입의 28일째에, 마우스는 무작위로 두 그룹으로 나누어졌고, 5613일째에희생될 때까지 비히클 또는 DAPT(10 mg/kg)를 투여하였다. 복부 초음파 화상 진찰은 28일에 AngII에 응하여 온화한, PPV, 및 방사형 긴장에 있는 점진적인 증가를 보여주었습니다(그림 5A-E). AngII 주입은 28일에서 56으로 약간 증가했으며 DAPT는 AngII 단독에 비해 마일드를 크게 변경하지 않았다(그림 5A 및 그림 5B). 그러나, PPV는 28일째부터 56일째에 AngII 주입으로 점진적으로 증가했으며, DAPT는 56일째에 PPV의 추가 증가를 현저히 감소시켰습니다(그림5C). DAPT가 유의한 효과를 나타내지 않은 반면, 혈관 벽의 탄성을 평가하는 파라미터는 DAPT가 유의한 효과를 나타내지않았다(도 5D 및 5E). PWV가 28일째에 MILD와 강하게 상관관계가 있다는것을 평가하는 것이 중요합니다(R2 =0.51, 도 5F),56일째에는 상관관계가 상대적으로 약한 반면(R2=0.22)(그림 5G). AAA의 대동맥 강성은 주로 대동맥 벽 아키텍처의 변화와 관련이 있습니다. 조직학적으로, AngII 주입은 대동맥의 내측 층에서 콜라겐 분해 및 프로테오틱 활성을 증가시하였다(도5H, 위쪽 행). DAPT 처리는 ECM 열화에서 이러한 변화를 최소화하였다(도5H, 하단 행).
그림 1: 계측기 설정. (A)마취 및 젤 워머유도챔버와 함께 초음파 기계의 전반적인 보기. (B)이미징 플랫폼과 트랜스듀서 시스템의 클로즈업 뷰. (C)복부 대강장의 짧은 축 이미지를 캡처하면서 트랜스듀서 배치의 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 최대 내발 경도(MILD)를 얻기 위한 M 모드 이미지 분석. 마우스로부터의 정상대동맥(A)및 복부 대동맥류(B)의 M 모드 이미지가도시되어 있다. (C)및(D)정상 마우스(C)와 AAA(D)를 가진 마우스의 수레내대장에서 심장 주기의수축기 에서 MILD 를 그려낸다. 세 개의 서로 다른 하트비트에서 측정은 표시된 대로 수행되고 평균 값이 계산됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 펄스 전파 속도(PPV)를 얻기 위한 EKV 이미지 분석. 일반 마우스 대자연에서 수집된 EKV 이미지. 분석은 측정(A)와소프트웨어 아이콘(B)를클릭하여 수행됩니다. C. 이제 PPV(D)를 클릭하고 다시 작은 창이 나타납니다(E). E에 표시된 것처럼 루멘의 위쪽 벽에 직사각형 상자를 그린 다음 수락을 클릭합니다. PPV 값은 F(화살표)에 도시된 바와 같이 얻어질 것이다. 보라색 선은 펄스 파의 변곡점을 설정하도록 조정된다(G). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 경사형 및 방사형 변형률 측정. 일반 마우스 대자연에서 수집된 EKV 이미지. 분석은 측정(A)와소프트웨어 아이콘(B)를클릭하여 수행됩니다. C. 이제 새ROI(D)추적을 클릭하면 E에 표시된 것처럼 루멘의 위쪽 및 아래쪽 벽에 자취가 표시되고 수락을 클릭합니다. [distensibility] 값은 표에서 F. 변형률(G)을클릭합니다. 커서가 방사형 변형 률그래프(H)의피크에 배치될 때 창에는 방사형 변형 값(%, 녹색 강조 표시 상자)이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: PPV는 확립된 AAA에서 대동맥의 구조적 특성과 상관관계가 있습니다. (a)대표적인 복부 초음파 이미지는 아포에-/- 마우스에서 표시된 실험군의 0, 28, 42 및 56일째에 MILD를 나타낸다. DAPT는 28일째에 시작되었습니다. 점선 노란색 선은 루멘의 윤곽을 그드러입니다. (B)표시된 그룹에서 MILD의 정량화 (보라색 및 녹색 색상은 AngII + 비히클 및 AngII + DAPT 처리 마우스를 각각 나타낸다 (n =16-18). (C, D, E) 앙II 및 DAPT 처리의 다양한 일에서 PPV, 도면 및 방사형 변형 (n = 8). (F와 G),28일째(F)와 56일째(G)에서PPV와 MILD사이의 피어슨의 상관관계를 보여주는 그래프. (H)콜라겐 염색(삼조로 염색되고 청색 염색으로 보임)에 대한 대표적인 조직학적 이미지 및 56일째에 DAPT 치료 유무에 관계없이 현장에서 체모그래피에 의한 프로테오용 활성. Tukey 다중 비교 테스트는 데이터 분석에 사용되었습니다. *P<0.05; ns = 중요하지 않습니다. H에서 50 μm의 배율. 이 수치는 샤르마 외(2019), 사이언티프 보고서(SREP-19-16491B)11에서채택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
초음파 이미징은 PPV, distensibility 및 방사형 변형의 측정을 통해 대강의 기능적 특성을 결정하는 강력한 기술을 제공합니다. 이 측정은 AAA의 마우스 모형을 공부하기 위한 특히 유익하고 생체 내 접근은 대동맥 병리학의 시간적 발달을 이해하는 것이 잠재적으로 중요한 세로 데이터의 수집을 허용합니다. 구체적으로, 생체내 대동맥강성의 측정은 EKV 데이터를 분석하여 PPV, 난성 및 방사형 변형에 의해 복부 대동맥에서 국소적으로 결정되며 AAA 불안정성16에대한 독립적인 위험 인자로 간주된다. 이러한 프로토콜에 설명된 기술은 비교적 간단하며 한 마우스에서 이미지 세트를 가져오는 데 8-10분밖에 걸리지 않습니다. 모든 이미지는 잘 정의되고 일관된 랜드마크를 사용하여 재현 가능하고 정밀한 데이터를 생성하는 단일 작업자가 수집하는 것이 바람직합니다.
이러한 도구의 적용에 대한 기술 전문 지식이 필요한 잠재적인 요인이 있습니다. 예를 들어, 첫째, PPV는 지역 동맥 강성의 간접적인 척도이기 때문에 국부동맥벽의 AAA 개발 정도를 전적으로 반영하지 않을 수 있다. 둘째, 친벽이 손상된 경우 PPV를 정확하게 측정하기 어려울 수 있습니다. 셋째, 기기 작동에 대한 전문 지식 없이도 선명한 해상도의 이미지를 얻는 것이 어려울 수 있습니다. 이러한 우려 중 일부는 작은 동물 연구를 위한 데이터 수집을 보존하고 향상시키면서 반점 잡음과 유물이 감소되는 초음파 이미징 시스템의 최근 버전에서 해결되었습니다.
대동맥 강성을 결정하기 위해 과거에 사용된 기술(도플러, 미세 내선술, 자기 공명 영상)의 초점은 2차원 이미지로 제한되었습니다. 초음파 영상으로부터 산출된 PPV는 대동맥 강성을 결정하는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법으로 부상하고 있으며 동맥압9,17과는 무관한 것으로 보인다. 표준 지수로 최대 직경을 사용하여 AAA의 일반적인 정의는 항상 임상 관찰과 안정적으로 상관 관계가 없다는 것을 주의하는 것이 중요합니다. 예를 들면, 몇몇 큰 동맥류는 안정하게 남아 있는 경향이 있는 동안 작은 동맥류는 파열할 수 있습니다18,19,20. 대동맥 경화는 동맥류 성장을 유발하는 대동맥 벽 응력 생성 초기 변화이며,10을 리모델링하고 AAA10의마우스 모델에서 Mmp2 및 Mmp9와 강하게 상관관계가 있습니다. 따라서, 대공의 직경 이외에, 기능적 분석은 AAA의 진행 및 안정성을 평가하는 중요한 정보를 제공할 수 있다.
이러한 프로토콜을 사용하여, 우리는 강력한 약리노치 억제제의 치료 잠재력을 검사했다 (2S-N-[(3,5-디플루오로페닐) 아세틸]-L-알라닐-2-페닐글리신 1,1-디메틸레틸 에스테르; DAPT)는 AAA11의AngII 유도 마우스 모델을 사용하여 미리 확립된 AAA의 진행 및 안정성에 관한 것이다. 복부 초음파 화상 진찰은 28일에 대조군 보다는 AngII에 응하여 Apoe-/- 마우스에 있는 온화한, PWV, 및 방사형 긴장에 있는 점진적인 증가를 보여주었습니다. MILD에서 더 이상 증가는 28일부터 56일까지 관찰되지않았다(그림 5). 그러나 PPV는 점진적으로 증가했으며 28일째에 비해 56일째에 상당히 높았습니다. DAPT에 의한 노치 신호의 억제와 함께, MILD 마우스는 56일째에 단독으로 AngII와 크게 다르지 않았다. 흥미롭게도, DAPT는 56일째에 AngII보다 현저히 낮은 PPV의 추가 증가를 방지하였다(도5C). DAPT 처리는 분과성 또는 방사형 변형에 유의하지않았다(도 5D,E). 흥미롭게도, PPV는 28일째(R2 =0.51)에 MILD와 강하게 상관관계가 있는 반면, 56일째에는 상관관계가 상대적으로 약했습니다(R2 =0.22; 그림 5F). 대동맥 강성의 이러한 변화는 AngII와 함께 증가된 콜라겐 분해 및 프로테오레이션 활성및 DAPT에 의한 감쇠에 반영되었다(도5H). 이 예제 연구는 AAA 진행과 안정성 모두의 시간 과정과 예측 가능성을 이해하는 초음파 기반 대동맥 강성 측정의 잠재적 가치를 강조합니다.
추가적으로, 초음파 기지를 둔 접근은 약리학적 내정간섭을 위한 잠재적인 역할을 평가하기에서 귀중한 것처럼 보입니다, 특히 발광 내 직경에 있는 변경의 독립적일 가능성이 있는 단계에서 (즉, 실제에 대한 기대를 넘어) 회귀)를 참조하십시오. 요약하면, 이러한 기술의 상세한 이해와 사용은 효과적인 치료 개입을위한 질병의 초기 단계에서 AAA의 예후를 평가하는 데 도움이될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 R01HL124155 (CPH)와 미주리 대학의 연구소에서 CPH에 자금을 지원했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II | Sigma | A9525 | |
| Apoe-/- mice | The Jackon lab |  |
|
| Clippers | WAHL | 1854 | |
| Cotton swab | Q-tips | ||
| DAPT | Sigma | D5942 | |
| Depilatory cream | Nair | LL9038 | |
| Electrode cream | Sigma | 17-05 | |
| Gel warmer | Thermasonic (Parker) | 82-03 (LED) | |
| Heating pad | Stryker | T/pump professional | |
| Isoflurane | VetOne | Fluriso TM | |
| Isoflurane vaporizer | Visualsonics | VS4244 | |
| Lubricating ophthalmic ointment | Lacri-lube | ||
| Osmotic pumps | Alzet | Model 2004 | |
| Oxygen tank | Air gas | ||
| Tranducer | Visualsonics | MS-400 or MS550D | |
| Ultrasonic gel | Parker | Aquasonic clear | |
| Ultrasound Imaging System | Visualsonics | Vevo 2100 | |
| Vevo Vasc Software | Visualsonics |
References
- Wanhainen, A. How to Define an Abdominal Aortic Aneurysm — Influence on Epidemiology and Clinical Practice. Scandinavian Journal of Surgery. 97, 105-109 (2008).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics—2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137, 67 (2018).
- Xu, J., Shi, G. -P. Vascular wall extracellular matrix proteins and vascular diseases. Biochimica et biophysica acta. 1842, 2106-2119 (2014).
- Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 105, 1605-1612 (2000).
- Au - Sawada, H., et al. Ultrasound Imaging of the Thoracic and Abdominal Aorta in Mice to Determine Aneurysm Dimensions. Journal of Visualized Experiments. , 59013 (2019).
- Raaz, U., et al. Segmental Aortic Stiffening Contributes to Experimental Abdominal Aortic Aneurysm Development. Circulation. 131, 1783-1795 (2015).
- van Disseldorp, E. M. J., et al. Influence of limited field-of-view on wall stress analysis in abdominal aortic aneurysms. Journal of Biomechanics. 49, 2405-2412 (2016).
- Miyatani, M., et al. Pulse wave velocity for assessment of arterial stiffness among people with spinal cord injury: a pilot study. Journal of Spinal Cord Medicine. 32, 72-78 (2009).
- Sharma, N., et al. Deficiency of IL12p40 (Interleukin 12 p40) Promotes Ang II (Angiotensin II)-Induced Abdominal Aortic Aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39, 212-223 (2019).
- Raaz, U., et al. Segmental Aortic Stiffening Contributes to Experimental Abdominal Aortic Aneurysm Development. Circulation. 131, 1783-1795 (2015).
- Sharma, N., et al. Pharmacological inhibition of Notch signaling regresses pre-established abdominal aortic aneurysm. Scientific Reports. , (2019).
- Bray, S. J. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
- Hans, C. P., et al. Inhibition of Notch1 signaling reduces abdominal aortic aneurysm in mice by attenuating macrophage-mediated inflammation. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 32, 3012-3023 (2012).
- Cheng, J., Koenig, S. N., Kuivaniemi, H. S., Garg, V., Hans, C. P. Pharmacological inhibitor of notch signaling stabilizes the progression of small abdominal aortic aneurysm in a mouse model. Journal of American Heart Association. 3, 001064 (2014).
- Hans, C. P., et al. Transcriptomics analysis reveals new insights into the roles of Notch1 signaling on macrophage polarization. The Journal of Immunology. 200, (2018).
- Paraskevas, K. I., et al. Evaluation of aortic stiffness (aortic pulse-wave velocity) before and after elective abdominal aortic aneurysm repair procedures: a pilot study. Open Cardiovascular Medicine Journal. 3, 173-175 (2009).
- Fortier, C., Desjardins, M. P., Agharazii, M. Aortic-Brachial Pulse Wave Velocity Ratio: A Measure of Arterial Stiffness Gradient Not Affected by Mean Arterial Pressure. Pulse. 5, 117-124 (2017).
- Golledge, J. Abdominal aortic aneurysm: update on pathogenesis and medical treatments. Nature Reviews Cardiology. 16 (4), 225-242 (2019).
- Choksy, S. A., Wilmink, A. B., Quick, C. R. Ruptured abdominal aortic aneurysm in the Huntingdon district: a 10-year experience. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 81, 27-31 (1999).
- Luo, F., Zhou, X. -L., Li, J. -J., Hui, R. -T. Inflammatory response is associated with aortic dissection. Ageing Research Reviews. 8, 31-35 (2009).
