Summary
Detta manuskript beskriver ett detaljerat protokoll för användning av högfrekvent ultraljudsavbildning för att mäta luminal diameter, puls förökningshastighet, distensibility och radiell belastning på en mus modell av bukkolorektal aneurysm.
Abstract
En bukkolorektal aneurysm (AAA) definieras som en lokaliserad utvidgning av bukstora som överstiger den maximala intraluminal diameter (MILD) med 1,5 gånger av sin ursprungliga storlek. Kliniska och experimentella studier har visat att små aneurysmer kan brista, medan en subpopulation av stora aneurysmer kan förbli stabil. Förutom mätning av intraluminal diameter av aorta, kan kunskap om strukturella egenskaper i fartygsväggen ge viktig information för att bedöma stabiliteten i AAA. Kolorektal förstyvning har nyligen dykt upp som ett tillförlitligt verktyg för att bestämma tidiga förändringar i kärlväggen. Pulsförökningshastighet (PPV) tillsammans med distensibilitet och radiell stam är mycket användbara ultraljudsbaserade metoder som är relevanta för att bedöma kolorektal styvhet. Det primära syftet med detta protokoll är att tillhandahålla en omfattande teknik för användning av ultraljud imaging system för att förvärva bilder och analysera de strukturella och funktionella egenskaperna hos aorta som bestäms av MILD, PPV, distensibility och radiell stam.
Introduction
En bukkolorektal aneurysm (AAA) representerar en betydande hjärt-kärlsjukdom som kännetecknas av en permanent lokaliserad dilatation av aorta överstiger den ursprungliga fartygets diameter med 1,5 gånger1. AAA rankas bland de 13 främsta dödsorsakerna i USA2. Utvecklingen av AAA tillskrivs degeneration av kolorektal väggen och elastin fragmentering, i slutändan leder till kolorektal bristning. Dessa förändringar i kolorektalväggen kan uppstå utan en signifikant ökning av den maximala intraluminaldiametern (MILD), vilket tyder på att MILD ensam inte är tillräcklig för att förutsäga sjukdomens svårighetsgrad3. Därför måste ytterligare faktorer identifieras för att upptäcka inledande förändringar i kolorektalväggen, som kan vägleda tidiga behandlingsalternativ. Det övergripande målet med detta protokoll är att ge en praktisk guide för att bedöma kolorektal funktionella egenskaper med ultraljudsavbildning som kännetecknas av mätningar av pulsförökningshastighet (PPV), distensibility och radiell stam.
En väl karakteriserad experimentell modell för att studera AAA, först beskrivs av Daugherty och kollegor, innebär subkutan infusion av angiotensin II (AngII) via osmotiska pumpar i Apoe-/- möss4. Exakt mätning av MILD med ultraljud imaging har varit avgörande för att karakterisera AAA i denna mus modell5. Även om histologiska förändringar under utvecklingen av AAA har studerats i stor utsträckning, har förändringar i kärlväggens funktionella egenskaper såsom kolorektal styvhet inte varit väl karakteriserade. Detta protokoll betonar användningen av högfrekvent ultraljud i kombination med sofistikerade analyser som kraftfulla verktyg för att studera den tidsmässiga utvecklingen av AAA. Dessa metoder gör det möjligt för oss att bedöma kärlväggens funktionella egenskaper mätt med PPV, distensibility och radiell stam.
Nyligen genomförda kliniska studier på försökspersoner med AAA, liksom i murinelastasinducerad AAA-modell, tyder på ett positivt samband mellan kolorektal styvhet och kolorektal diameter6,7. PPV, en indikator på kolorektal styvhet, accepteras som en utmärkt mätning för kvantifiering förändringar i styvhet i kärlväggen6,8. PPV beräknas genom att mäta transittiden för pulsvågsformen på två platser längs vaskulaturen, vilket ger en regional bedömning av kolorektal styvhet. Vi har nyligen visat att ökad kolorektal styvhet mätt med PPV, och på cellnivå som bestäms med hjälp av atomkraftmikroskopi, korrelerar positivt med aneurysm utveckling9. Vidare tyder litteraturen på att kolorektal styvhet kan föregå aneurysmal dilatation och därmed kan ge användbar information om regionala inneboende egenskaper fartygsväggen under utvecklingen av AAA10. På samma sätt är desibilitet och stammätningar kvantifieringsverktyg en åtgärd för att mäta tidigare förändringar av arteriell kondition. Friska artärer är flexibla och elastiska, medan med ökad styvhet och mindre elasticitet, distensibility och stam minskar. Här ger vi en praktisk guide och steg för steg protokoll för användning av en högfrekvent ultraljud system för att mäta MILD, PPV, distensibility och radiell stam hos möss. Protokollet ger tekniska metoder som bör användas tillsammans med den grundläggande informationen från manualer för specifika ultraljud imaging instrument och den medföljande video tutorial. Viktigt, i våra händer det beskrivna bildprotokollet ger reproducerbara och korrekta data som verkar värdefulla i studien av utvecklingen och utvecklingen av experimentellAA.
För att ytterligare visa nyttan av ultraljudsavbildning ger vi exempel bilder och mätningar från våra egna studier som syftar till att använda farmakologiska metoder för att förhindra experimentell AAA11. Specifikt har hacksignalering föreslagits att vara involverad i flera aspekter av vaskulär utveckling och inflammation12. Med hjälp av genhaploinsufficiens och farmakologiska metoder har vi tidigare visat att Notch-hämning minskar utvecklingen av AAA hos möss genom att förhindra infiltration av makrofager på platsen för kärlskada13,14,15. För den aktuella artikeln, med hjälp av farmakologiska metoden för Notch hämning fokuserar vi på förhållandet mellan kolorektal styvhet och faktorer som rör AAA. Dessa studier visar att Notch hämning minskar kolorektal styvhet, vilket är ett mått på AAA progression11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet för hantering av möss och ultraljud stomme godkändes av University of Missouri Institutional Animal Care and Use Committee (djurprotokoll nummer 8799) och genomfördes enligt AAALAC International.
1. Utrustning satts upp och förbereder möss
- Installation av utrustning
- Slå på ultraljudsinstrumentet, ultraljudgelvarmare och värmedynan.
- Öppna ultraljudsprogrammet och ange studienamnet och beskrivande information för varje mus.
- Välj programmet som General Imaging.
- Välj lämplig givare för bukavbildning (bild 1B,C). I det här experimentet används MS400-givaren.
- Se till att anestesiisofflunoch syrenivåer är tillräckliga för varje experimentell session.
- Rengör ultraljudsdjursavbildningsplattformen.
- Musberedning
- Placera musburen ovanpå en värmedyna (36,5 till 38,5 °C).
- Håll försiktigt musen vid svansbasen och placera i den syrefyllda isoflurankammaren.
- Rikta isofluran och syreflödet till induktionskammaren.
- Slå på isofluran spridare och ställ in isofluran nivå till 1-2% vol / vol. Slå på syretanken trycket till 1-2 L / min.
- Efter ~ 2 min, bekräfta tillräckligt djup anestesi genom frånvaron av tillbakadragande reflexer på nypa fotdynan på musen.
- Stäng sedan av induktionskammarens matningsgren och slå på grenen riktad till anestesinäskonen.
- Överför musen från induktionskammaren till ultraljudsbildningsstadiet och placera anestesikonen över djurets näsa.
- Luta djuravbildningsplattformen runt 10° till det nedre högra hörnet för optimal skanning (bild 1B).
- Lägg en droppe steril oftalmisk lösning i båda ögonen på möss för att förhindra torkning under anestesi.
- Placera musen i supine-positionen med näsan ini narinnankonen.
- Applicera elektrogelen på alla fyra tassarna med hjälp av en bomullspinne och tejpa tassarna på kopparledningarna på djuravbildningsplattformen för elektrokardiogramavläsningar(figur 1C).
- Använd klippare för att raka håret på bildplatsen och applicera sedan depilatorisk kräm för att ta bort återstående päls. Låt stå i mindre än 1 min.
- Torka försiktigt av krämen och håret med en fuktig pappershandduk.
- Övervaka andningen och se till att pulsen bibehålls mellan 450-550 slag/min. Om under denna nivå, minska isofluran flödet och vänta tills pulsen återhämtar sig.
- Applicera förvärmd ultraljudsgel (37 °C) på den beredda hudplatsen och fäst givaren på hållaren och sänk ned tills den vidrör gelen (figur 1C).
2. Ultraljud imaging av buken aorta
- Placera givaren horisontellt (dvs. vinkelrätt mot musens mittlinje).
- Släta ultraljudgelen och ta bort bubblor med hjälp av träpinnen i en bomullspinne.
- Sänk givaren och placera 0,5 - 1 cm under membranet efter att ha vidrört gelen. Nu börjar observera bilderna.
- Visualisera buken aorta i den korta axeln(bild 1C).
B-läge är standardläget och det mest effektiva läget för att anatomiskt hitta aorta och placera givaren. Buken aorta identifieras genom förekomsten av pulsatile flöde med hjälp av färg Doppler och power Doppler lägen i den korta axeln (dvs. den omkrets tvärsnitt av stora kroppspulsås). Justera mikromanipulatorerna på djurscenen och givaren för att föra tvärdelen av aorta till mitten av bilden. - Rotera försiktigt givaren 90° medurs och justera långsamt x-axelnmicromanipulatorratten för att visualisera aorta i lång axelvy (längsgående del av stora rasten).
OBS: I många fall kan mag-tarmgaser störa bilden, eller aorta kanske inte är i optimal vinkel för att möjliggöra en tydlig lång axelvy. Justera givarens vinkel långsamt och horisontellt tills en acceptabel lång axelvy erhålls. Om problemen kvarstår, höj givaren, kontrollera om luftbubblor under givaren, justera något djurscenens lutningsvinkel, applicera stiftgeler igen och upprepa alla steg igen. - Ställ in fokuszonen och djupet i området för aorta med hjälp av omkopplarna Fokuszon och fokusdjup. Justera tidsersättningsreglaget manuellt för att mörkna aortas lumen för att uppnå en optimal kontrast av aortaväggen.
- Justera y-axeln manipulator för att visualisera förgreningspunkterna i den överlägsna mesenteric och rätt njurartärer. Använd rätt renal artär som ett landmärke för att fånga bilden av suprarenal aorta(Figur 2A).
- Spela in minst 100 bildrutor av B-lägesbilder på suprarenal aorta.
- Tryck cinestore för att spara B-lägesbilder.
- Tryck på M-lägesknappen på instrumenttangentbordet för att aktivera M-lägesinspelning. Rulla markörkulan för att föra den gula indikatorlinjen till en normal stora stenta sektioner med klar fartyg väggbild, eller till de sektioner där maximal diameter aneurysm observeras.
- Tryck på SV/gate-växla och justera markörkulan för att säkerställa att kärlväggarna ingår i mätfästet. Tryck på uppdatering för att registrera M-läge smått och tryck cinestore att fånga (bild 2A,B).
OBS: Maximal diameter på aneurysmen kanske inte är i samma bildplan som den optimala långa axelvyn över stora formen. Justera x-axelns manipulatorknopp något för varje M-lägesmätning för att säkerställa att milden för varje sektion fångas in. - Om du vill hämta EKG-gated Kilohertz Visualization (EKV) bilder trycker du på B-lägesknappen för att gå tillbaka till B-lägesinspelning.
OBS: Om bilderna inte är skarpa, justera x-axeln manipulator för att uppnå den skarpaste bilden av övre väggen i lumen över en sektionlängd (dvs., > 6 mm). - Tryck på knappen För physioinställningar på tangentbordet och välj Andninggating. Justera gating fördröjning och fönster manuellt för att registrera data endast under de plattare delarna av andningsvågen. Inspelningsavsnitten visas som färgade block på spårningen av andningen av andningen.
OBS: Utan justering av andningen gating, EKV bilderna kommer att suddas ut på grund av den normala förflyttning av djur under andningen. - Tryck på EKV-knappen för att aktivera EKV-läget. På lämplig meny väljer du Standardupplösning och bildrutehastighet 3000 eller högre. Välj fortsätt för att spela in EKV-bilder. Tryck cinestore för att spara bilderna. Använd EKV-lägesavbildning för att få mätningar av pulsförökningshastighet (PPV), distensialitet och radiell stam.
OBS: EKV inspelning kan misslyckas om det finns onormala fluktuationer i andning, är djuret smittas för snabbt, eller ram hastigheter inställningar är för höga. I så fall, ställ in ramhastigheten lägre och vänta på att djurandningen stabiliseras. Ställa in bildfrekvensen på 3000 är vanligtvis lämpligt för både möss och råttor.
3. Steg efter avbildning
- Torka försiktigt ultraljudsgelen från buken av musen med en pappershandduk fuktad med varmt vatten.
- Placera musen tillbaka i sin hembur på en värmeplatta.
- Stäng av isofluranmaskinen, rengör djurbildplattformen och givaren med fuktiga våtservetter.
- Överför bilddata som samlats in under ultraljudsskanningen till hårddisken.
- Stäng av ultraljudsinstrumentet.
- När musen återhämtar sig från anestesi och är alert, ta bort värmedynan och returnera buren till djurhuset rack.
4. Analys av bukkolorta bilder
- Analys av M-lägesbilder för att mäta MILD
- Öppna ultraljudsprogrammet och ange studienamnet och beskrivande information för varje mus.
- Öppna ultraljudsdata i analysprogrammet och öppna M-lägesbilden och pausa hjärtslagen.
- Klicka på Mått.
- Välj kärlpaketet från listrutan. Klicka på djup och rita en linje över kolorektallumen som sträcker sig från innervägg till vägg(figur 2C,D).
OBS: För konsekvens bör mätningarna göras vid cardiaccykelns systoliska fas när aorta är maximalt expanderad. Rita tre linjer över tre olika hjärtslag för att få korrekta och genomsnittliga mätningar av MILD. I AAA görs mätningarna vid maximal dilatation av aorta. Det är också lämpligt att snabba djuren 4-6 h innan du samlar in bilder för att undvika störningar från tarmmotilitet och säkerställa bildklarhet.
- Analys för pulsförökningshastighet (PPV)
- Öppna EKV-bilden och pausa pulsslagspulsen.
- Öppna ett nytt fönster på analysprogrammet (t.ex. Vevo Vac) genom att klicka på namnikonen.
- Klicka på PPV alternativet (pil i bild 3D). Ett litet fönster visas vidare med bilden av aorta.
- Rita en rektangulär låda genom att klicka på den övre kärlväggen och dra pekaren i ca 4 mm som täcker båda suprarenal aorts väggar.
OBS: Håll lådans längd konsekvent (~4 mm) för alla bilder. Användaren kan justera den rektangulära rutan genom att rotera för att justera rutan och välja linjen och sedan dra till en ny position på det fartyg som analyseras för att få pulsvågens lämpligaste och tydligaste böjning. De lodräta raderna med data från rektangeln visas och identifieras som vänster (övre bild) och höger (nederstbild) på roi. För en bättre visualisering av böjningsction av pulsvågen, är det ibland användbart för dragrutan endast på den övre väggen som visas i figur 3. Programvaran kommer automatiskt att beräkna PPV (m/s). Det är dock alltid bättre att manuellt justera de lila linjerna för att ställa in den exakta böjningspunkten på pulsvågorna och PPV kommer att förändras därefter. - Välj slutligen kommandot Acceptera för att spara PPV-värdena. Exportera siffrorna och data till datalagringsenheten.
- Analys för distensibilitet och radiell stamning
- Öppna EKV-bilden och pausa pulsslagspulsen.
- Klicka på programikonen. Programvaran kommer att öppna ett nytt fönster.
- Klicka på den nya avkastningen och rita en rektangulär låda på fartygets båda väggar. Programvaran spårar automatiskt fartygets övre och nedre väggar. Användaren kan justera spårningen för att justera på väggen genom att klicka på gröna punkter(bild 4A,B).
- Acceptera nu spårningen. Programvaran beräknar distensibility (1/Mpa) i den valda avkastningen.
- För den radiella stammätningen väljer du lämpligt stamalternativ från menyraderna längst upp till vänster. Bilderna för radiell stam och tangentiell stam öppnas.
- Få värdet för radiella påfrestningar (%) genom att flytta markören på kurvans topp. Exportera data som bilder eller i videoformat (bild 4A,B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa M-lägebilder av den normala och aneurysmal bukstora från möss visas i figur 2A respektive figur 2B. Suprarenal buken aorta identifieras av sin plats bredvid höger renal artär och överlägsen mesenteric artär(figur 2A). Representativa bilder som används för beräkning av MILD, vid tre olika hjärtslag i den systoliska hjärtcykeln, i normal och aneurysmal aorta visas i figur 2C,D respektive. I den situation där en kolorektal aneurysm har utvecklats bestäms luminaldiametern genom att dra en vinkelrät gul linje mellan lumens två inre kanter vid maximal dilatation(figur 2B). Tre oberoende mätningar beräknas vanligtvis bestämma en korrekt intraluminal diameter.
Representativa EKV-bilder av bukaorta som används i analys av PPV visas i figur 3. PPV beräknas genom att rita en rektangulär låda på den luminala väggen i suprarenal aorta(figur 3E)och justering av de lila vertikala linjerna med data som erhållits från den rektangulära lådan(figur 3F). De lila linjerna bör justeras för att ställa in pulsvågornas böjningspunkt. Representativa EKV-bilder av bukaorta som lämpar sig för analys av distensialitet och radiella stammar visas i figur 4. Distensibilitet och radiell stam beräknas genom att spåra suprarenal aortas luminalväggar enligt figur 4E. Värdet för distensibility (1/MPa) erhålls genom att välja alternativet distensibility/elasticitet från rullgardinsmenyn i rutan (röd pil, figur 4F). Den radiella stammen (%) erhålls genom att välja det radiella stamalternativet (figur 4G)och flytta markören till toppen av den radiella stamgrafen(figur 4H).
Vi har validerat betydelsen av PPV i AngII-inducerad mus modell av AAA och ytterligare undersökt den terapeutiska potentialen hos en Notch hämmare (N-[N-(3,5-difluorifenacetyl)-L-alanyl]-(S)-phenylglycine t-butyl ester; DAPT) om utvecklingen och stabiliteten hos den på förinrättade AAA. Närmare bestämt utfördes alla dessa aneurysmstudier på 8-10 veckor gamla Apoe-/- manliga möss efter infusion av AngII av publicerade protokoll4,13. På dag 28 av AngII infusion, möss var slumpmässigt uppdelad i två grupper och administrerades fordon eller DAPT (10 mg/kg) tills offer på dag 5613. Transabdominal ultraljud imaging visade en progressiv ökning av MILD, PPV, och en minskning av distensialitet och radiell stam som svar på AngII dag 28(figur 5A-E). AngII infusion ökade marginellt MILD från dag 28 till 56 och DAPT förändradeinte signifikant MILD jämfört med AngII ensam(figur 5A och figur 5B). PPV ökade dock successivt med AngII infusion från dag 28 till dag 56 och DAPT minskade avsevärt ytterligare ökningar i PPV på dag 56(figur 5C). Distensibilitet och radiellstammar minskade parametrar för att bedöma kärlväggens elasticitet med AngII-infusion medan DAPT inte visade någon signifikant effekt(figur 5D och 5E). Det är viktigt att inse att PWV korrelerade starkt med MILD på dag 28 (R2=0,51, figur 5F), medan korrelationen dag 56 var relativt svag (R2=0,22) (figur 5G). Kolorektal styvhet i AAA är främst förknippad med förändringar i kolorektal väggarkitektur. Histologiskt, AngII infusion ökad kollagen nedbrytning och proteolytisk aktivitet i det mediala lagret av stora havet(figur 5H, översta raden). DAPT-behandling minimerade sådana förändringar i ECM-nedbrytningen(figur 5H, nedre raden).
Bild 1: Installationen av instrumentet. (A) Övergripande utsikt över ultraljudsmaskinen tillsammans med induktionskammare för anestesi och gelvärmare. (B)Närbild av bildplattformen och givarensystemet. (C)Synen på givarens placering samtidigt som den tar en kort axelbild av bukaorta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Analys av M-lägesbilder för att erhålla maximal intraluminal diameter (MILD). M-lägesbilderna av normal aorta (A) och aorta med bukkolorektal aneurysm(B)från möss visas. (C)och (D),MILD dras vid systolisk fas av hjärtcykeln i suprarenal aorta av normala möss (C)och möss med AAA (D). Mätningar vid tre olika hjärtslag tas enligt bilden och medelvärdet beräknas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Analys av EKV-bilder för att erhålla pulsförökningshastighet (PPV). EKV bilder som samlats in från normal musaorta. Analys görs genom att klicka på mätningar (A) och mjukvaruikonen (B). Ett nytt fönster visas med ikonerna på höger sida, som visas i C. Nu klickar du på PPV(D) och igen, ett litet fönster kommer att visas (E). Rita en rektangulär låda på den övre väggen i lumen som visas i E och klicka acceptera. PPV-värdet erhålls enligt bilden i F (pil). De lila linjerna justeras för att ställa in brytpunkten för pulsvågorna (G). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Mätning av distensibilitet och radiell stam. EKV bilder som samlats in från normal musaorta. Analys görs genom att klicka på mätningar (A) och mjukvaruikonen (B). Ett nytt fönster visas med ikonerna på höger sida, som visas i C. Nu, klicka på spåra nya ROI (D), ett nytt fönster kommer att visas med spår på den övre och nedre väggen i lumen som visas i E och klicka acceptera. Värdet för distensibility erhålls i tabellen som visas i F. För stam, klicka på stam(G). Fönstret visar det radiella stamvärdet (%, grön markerad ruta), eftersom markören placeras på toppen av den radiella stamgrafen (H). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: PPV korrelerar med strukturella egenskaper hos stora är i den etablerade AAA. (A)Representativa transabdominal ultraljud bilder som visar mild på dag 0, 28, 42 och 56 av angivna experimentella grupper i Apoe-/- möss. DAPT startades dag 28. Prickade gula linjer beskriver lumen. (B)Kvantifiering av MILD i de angivna grupperna (lila och grön färg visar AngII + fordon och AngII + DAPT behandlade möss respektive (n=16-18). (C, D och E) PPV, distensibility och radiell stam vid olika dagar av AngII och DAPT behandlingar (n = 8). (F och G), Grafer som visar Pearsons samband mellan PPV och MILD dag 28 (F) och dag 56(G). (H)Representativa histologiska bilder för kollagenfärgning (färgas med trikrom och ses som blå färgning) och proteolytisk aktivitet genom in situ zymografi med eller utan DAPT-behandling dag 56. Tukey flera jämförelser test användes för dataanalys. *P<0.05; ns = icke-signifikant. Skala 50 μm i H. Denna siffra är anpassad från Sharma et al. (2019), Scientifc Reports (SREP-19-16491B)11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ultraljudsavbildning ger en kraftfull teknik för att bestämma funktionella egenskaper hos aorta genom mätningar av PPV, distensibility och radiell stam. Dessa mätningar är särskilt lärorika för att studera musmodeller av AAA och in vivo-metoden möjliggör insamling av längsgående data som är potentiellt viktiga för att förstå tidsmässiga utveckling av kolorektal patologi. Specifikt bestäms mätningar av in vivo kolorektal styvhet lokalt i buken aorta av PPV, distensibility och radiell stam genom att analysera EKV-data och betraktas som en oberoende riskfaktor för AAA instabilitet16. De tekniker som beskrivs i dessa protokoll är relativt rakt fram och tar bara 8-10 min för att få bilduppsättningar från en mus. Alla bilder bör helst samlas in av en enda operatör med väldefinierade och konsekventa landmärken för att generera reproducerbara och exakta data.
Det finns potentiella faktorer som kräver teknisk expertis för tillämpningar av dessa verktyg. Till exempel, för det första, PPV kanske inte enbart återspeglar graden av AAA utveckling i den lokala arteriella väggen eftersom det är ett indirekt mått på regional arteriell stelhet. För det andra kan det vara svårt att exakt mäta PPV om den hotfulla väggen är skadad. För det tredje kan det vara svårt att få skarpa upplösningsbilder utan expertis i driften av instrumentet. Några av dessa problem har tagits upp i de senaste versionerna av ultraljud imaging system där speckle buller och artefakter minskas, samtidigt bevara och förbättra datainsamling för små djurstudier.
Fokus för tekniker som används i det förflutna (Doppler, mikroangiografi, magnetisk resonanstomografi) för att bestämma kolorektal styvhet var begränsade till tvådimensionella bilder. PPV beräknas från ultraljud imaging har dykt upp som en pålitlig och reproducerbar metod för att bestämma kolorektal styvhet och verkar vara oberoende av arteriellt tryck9,17. Det är viktigt att notera att den rådande definitionen av AAA med maximal diameter som standardindex inte alltid på ett tillförlitligt sätt korrelerar med kliniska observationer. Till exempel kan små aneurysmer brista medan vissa stora stora aneurysmer tenderar att förbli stabil18,19,20. Kolorektal förstyvning är en tidig förändring som genererar kolorektal vägg stress som utlöser aneurysmal tillväxt, och ombyggnad10 och har varit starkt korrelerade med Mmp2 och Mmp9 i musmodeller av AAA10. Förutom aortas diameter kan funktionella analyser därför ge viktig information för att bedöma AAA:s progression och stabilitet.
Med hjälp av dessa protokoll har vi undersökt den terapeutiska potentialen hos en potent farmakologisk Notch-hämmare (2S-N-[(3,5-Difluorifenyl) acetyl]-L-alanyl-2-fenylglycin 1,1-dimetyletylester; DAPT) om progression och stabilitet i företablerade AAA med hjälp av en AngII-inducerad musmodell av AAA11. Transabdominal ultraljud imaging visade en progressiv ökning av MILD, PWV, och en minskning av distensibility och radiell stam i Apoe-/- möss som svar på AngII än kontroller på dag 28. Ingen ytterligare ökning av MILD observerades efter dag 28 till dag 56(figur 5). PPV ökade dock successivt och var betydligt högre på dag 56 jämfört med dag 28. Med hämning av Notch signalering av DAPT, milda möss var inte signifikant annorlunda än AngII ensam på dag 56. Intressant nog förhindrade DAPT ytterligare ökning av PPV så att det var betydligt lägre än AngII på dag 56(figur 5C). DAPT-behandlingen påverkade inte signifikant distensibilitet eller radiell stam(figur 5D,E). Intressant nog korrelerade PPV starkt med MILD på dag 28 (R2=0,51), medan korrelationen dag 56 var relativt svag (R2=0,22; Bild 5F). Dessa förändringar i kolorektalstyvheten återspeglades i den ökade kollagennedbrytningen och proteolytisk aktivitet med AngII och dapts dapts dapts dämpning (figur 5H). Denna exempelstudie belyser det potentiella värdet av ultraljud-baserade kolorektal stelhet mätbara i att förstå tidskurs och förutsägbarhet både AAA progression och stabilitet.
Vidare verkar ultraljudsbaserade metoden värdefull vid bedömningen av den potentiella rollen för farmakologiska interventioner, särskilt i etapper som sannolikt kommer att vara oberoende av förändringar i intraluminal diameter (dvs. utöver förväntan om faktiska regression). Sammanfattningsvis kommer detaljerad förståelse och användning av sådan teknik att gynnas vid bedömningen av prognosen för AAA i ett tidigt skede av sjukdomen för effektiva terapeutiska interventioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av R01HL124155 (CPH) och finansiering från Research Institute vid University of Missouri till CPH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II | Sigma | A9525 | |
| Apoe-/- mice | The Jackon lab |  |
|
| Clippers | WAHL | 1854 | |
| Cotton swab | Q-tips | ||
| DAPT | Sigma | D5942 | |
| Depilatory cream | Nair | LL9038 | |
| Electrode cream | Sigma | 17-05 | |
| Gel warmer | Thermasonic (Parker) | 82-03 (LED) | |
| Heating pad | Stryker | T/pump professional | |
| Isoflurane | VetOne | Fluriso TM | |
| Isoflurane vaporizer | Visualsonics | VS4244 | |
| Lubricating ophthalmic ointment | Lacri-lube | ||
| Osmotic pumps | Alzet | Model 2004 | |
| Oxygen tank | Air gas | ||
| Tranducer | Visualsonics | MS-400 or MS550D | |
| Ultrasonic gel | Parker | Aquasonic clear | |
| Ultrasound Imaging System | Visualsonics | Vevo 2100 | |
| Vevo Vasc Software | Visualsonics |
References
- Wanhainen, A. How to Define an Abdominal Aortic Aneurysm — Influence on Epidemiology and Clinical Practice. Scandinavian Journal of Surgery. 97, 105-109 (2008).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics—2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137, 67 (2018).
- Xu, J., Shi, G. -P. Vascular wall extracellular matrix proteins and vascular diseases. Biochimica et biophysica acta. 1842, 2106-2119 (2014).
- Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 105, 1605-1612 (2000).
- Au - Sawada, H., et al. Ultrasound Imaging of the Thoracic and Abdominal Aorta in Mice to Determine Aneurysm Dimensions. Journal of Visualized Experiments. , 59013 (2019).
- Raaz, U., et al. Segmental Aortic Stiffening Contributes to Experimental Abdominal Aortic Aneurysm Development. Circulation. 131, 1783-1795 (2015).
- van Disseldorp, E. M. J., et al. Influence of limited field-of-view on wall stress analysis in abdominal aortic aneurysms. Journal of Biomechanics. 49, 2405-2412 (2016).
- Miyatani, M., et al. Pulse wave velocity for assessment of arterial stiffness among people with spinal cord injury: a pilot study. Journal of Spinal Cord Medicine. 32, 72-78 (2009).
- Sharma, N., et al. Deficiency of IL12p40 (Interleukin 12 p40) Promotes Ang II (Angiotensin II)-Induced Abdominal Aortic Aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39, 212-223 (2019).
- Raaz, U., et al. Segmental Aortic Stiffening Contributes to Experimental Abdominal Aortic Aneurysm Development. Circulation. 131, 1783-1795 (2015).
- Sharma, N., et al. Pharmacological inhibition of Notch signaling regresses pre-established abdominal aortic aneurysm. Scientific Reports. , (2019).
- Bray, S. J. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
- Hans, C. P., et al. Inhibition of Notch1 signaling reduces abdominal aortic aneurysm in mice by attenuating macrophage-mediated inflammation. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 32, 3012-3023 (2012).
- Cheng, J., Koenig, S. N., Kuivaniemi, H. S., Garg, V., Hans, C. P. Pharmacological inhibitor of notch signaling stabilizes the progression of small abdominal aortic aneurysm in a mouse model. Journal of American Heart Association. 3, 001064 (2014).
- Hans, C. P., et al. Transcriptomics analysis reveals new insights into the roles of Notch1 signaling on macrophage polarization. The Journal of Immunology. 200, (2018).
- Paraskevas, K. I., et al. Evaluation of aortic stiffness (aortic pulse-wave velocity) before and after elective abdominal aortic aneurysm repair procedures: a pilot study. Open Cardiovascular Medicine Journal. 3, 173-175 (2009).
- Fortier, C., Desjardins, M. P., Agharazii, M. Aortic-Brachial Pulse Wave Velocity Ratio: A Measure of Arterial Stiffness Gradient Not Affected by Mean Arterial Pressure. Pulse. 5, 117-124 (2017).
- Golledge, J. Abdominal aortic aneurysm: update on pathogenesis and medical treatments. Nature Reviews Cardiology. 16 (4), 225-242 (2019).
- Choksy, S. A., Wilmink, A. B., Quick, C. R. Ruptured abdominal aortic aneurysm in the Huntingdon district: a 10-year experience. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 81, 27-31 (1999).
- Luo, F., Zhou, X. -L., Li, J. -J., Hui, R. -T. Inflammatory response is associated with aortic dissection. Ageing Research Reviews. 8, 31-35 (2009).
