פרוטוקול זה מתאר את השלבים שננקטו כדי לגרום לגידולים קראס ריאות בעכברים, כמו גם כימות של גידולים שנוצרו על ידי הדמיה אולטרסאונד. גידולים קטנים הם דמיינו בזמן מוקדם נקודות כמו B-קווים. בנקודות זמן מאוחרות יותר, המידות היחסיות של נפח הגידול מושגת על ידי כלי המדידה בתוכנת האולטרסאונד.
עם ~ 1,600,000 קורבנות בשנה, סרטן ריאות תורם מאוד את הנטל העולמי של סרטן. סרטן ריאות הוא מונע בחלקו על ידי שינויים גנטיים אונגנים כגון אונקראס גן, אשר מהווה ~ 25% ממקרי סרטן ריאות. הקושי של מיקוד רפואי קראס מונחה סרטן הריאות בחלקו נובע בעל מודלים עניים שיכולים לחקות את ההתקדמות של המחלה במעבדה. אנו מתארים שיטה המאפשרת את הקוונפיקציה היחסית של גידולים קראס ריאה הראשי ב-inducible LSL-קראס G12D מודל העכבר באמצעות הדמיה אולטרסאונד. שיטה זו מסתמכת על בהירות (ב)-רכישת מצב של הריאה בתוך כימומה. גידולים שנוצרו בתחילה במודל זה הם דמיינו כמו B-lines ניתן לכמת על ידי ספירת מספר ה-B-lines הנמצאים תמונות שנרכשו. אלה ייצגו את מספר הגידול היחסי שנוצר על פני השטח של ריאה העכבר. כמו גידולים שנוצרו להתפתח עם הזמן, הם נתפסים כמו בתרי עמוק בתוך הריאה מבכיצ’ימה. מאז היקף הגידול נוצר הוא מוגדר היטב, חישוב נפח הגידול היחסי מושגת על ידי מדידת האורך והרוחב של הגידול ויישום אותם בנוסחה המשמשת עבור מדידות הגידול קליבר. הדמיה אולטרסאונד היא טכניקה לא פולשנית, מהיר וידידותי למשתמש המשמש לעתים קרובות עבור כימות הגידול בעכברים. למרות שפריטים מסוימים עשויים להופיע בעת קבלת תמונות אולטרסאונד, זה הוכח כי טכניקה זו הדמיה היא יתרון יותר עבור כימות הגידול בעכברים לעומת טכניקות דימות אחרות כגון טומוגרפיה ממוחשבת (CT) הדמיה הדמיה ביולומינסנציה (בלי). חוקרים יכולים לחקור מטרות טיפוליות הרומן באמצעות טכניקה זו על ידי השוואת ייזום הגידול ריאות התקדמות בין קבוצות שונות של עכברים.
כמו הגורם המוביל של מקרי מוות הקשורים לסרטן ברחבי העולם, סרטן הריאות נשאר עקשן לטיפולים, בעיקר בשל חוסר מודלים רלוונטיים טרום קליניים שיכולים ללכוד את המחלה במעבדה1. סביב 25% ממקרי סרטן הריאות הם בשל מוטציות ב-קראס אונגן2. סרטן ריאות מונחה קראס משויך לעתים קרובות עם פרוגנוזה גרועה תגובה נמוכה לטיפול, הדגשת החשיבות של מחקרים נוספים במחלה זו2.
אנו אופטימיזציה שיטה המאפשרת את ההערכה היחסית של גידול בריאות הגידול בזמן אמת ב-קראס סרטן ריאות המושרה עכברים המוסמכים. אנו משתמשים ב-לקס-Stop-קראס G12D (lsl-קראס G12D) עכברים שבהם הקראס G12D אונגן ניתן לבטא על ידי וקטורים מבוססי ויראלי3,4. וקטורים אלה מונעים על ידי הידרלאוס 2, המאפשר זיהום נגיפי להתקיים במיוחד מכתשיים תאים אפיתל5. בנוסף, כדי להאיץ את החניכה ואת ההתקדמות של גידולים בריאה, המבנה לויראלי מבטא גם P53 רין מיזם U6/H1 (המבנה הננגיפי להלן יהיה מכונה Ca2Cre-shp53)6. הרלוונטיות הביולוגית של שיטה זו טמונה בקורס הטבעי של התפתחות הגידול בריאות בעכברים בניגוד ל-xenografts של גידולים שאינם אורתודעיים בעכברים. מכשול באמצעות שיטת אורתוטופית מפקחת על גידול הגידול בריאות מבלי להקריב את העכבר. כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו אופטימיזציה הדמיה אולטרסאונד כדי לאפשר ניתוח של התקדמות הגידול בריאות במצב דו מימדי (2D) במודל העכבר הזה. התחלת גידולים ב 7 שבועות לאחר ההדבקה משתקפים כמו B-lines בתמונות אולטרסאונד, אשר ניתן לספור, אבל לא ישקף את המספר המדויק של גידולים הנמצאים על הריאה. הקווים הלבנים מאופיינים בקווים אנכיים לבנים, הנובעים מהקו הפלאורלי בתוך הריאה,8. גידולים גדולים ניתן לדמיין לאחר 18 שבועות של זיהום. הנפח היחסי של גידולים אלה הוא כימות על ידי מדידות 2D שנעשו באולטרסאונד.
שיטה זו היא אופטימלית עבור החוקרים לחקור את ההשפעה של תרופות תרופתי על גידול הגידול בריאות במודל העכבר LSL-קראס G12D. בנוסף, התקדמות הגידול בריאות ניתן להשוות בין עכברים עם לשונות גנטית שונים, כדי לבחון את החשיבות של נוכחות או העדר של גנים מסוימים/חלבונים על פיתוח נפח הגידול בריאות.
אנו מדגימים שיטה שיכולה להעריך גידול ריאות הצמיחה בinducible LSL-קראס G12D העכבר מודל על ידי אולטרסאונד. שיטה זו יכולה לשמש להערכת ההשפעה של מעכבי פרמקולוגית על גידול הגידול בריאות. זה יכול לשמש גם כדי להשוות את גידול הגידול בריאות בין עכברים של רקעים גנטיים שונים. השימוש בטכניקה זו אינו דורש מיומ…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים ד ר I. Verma עבור וקטור Ca2Cre-shp53 לנטינגיי. העבודה נתמכת על ידי כספים מן המכונים הקנדיים לחקר בריאות (מנקה CIHR 137113) ל-AEK.
0.45 μm Acrodisc Syringe Filters | Pall Corporation | PN 4614 | |
100-mm Cell Cultre Plate | CELLSTAR | 664 160 | |
6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657 160 | |
Amicon Ultra – 15 Centrifugal Filter Units | Merck Millipore Ltd. | UFC910024 | |
BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
CA2Cre-shp53 lentiviral vector | From Dr. I Verma Laboratory | ||
DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
FBS | Multicell | 80450 | |
LSL-KRASG12D mouse | JAX Mice | 8179 | |
MX550S; Centre Transmit: 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
Pen/strep | Multicell | 450-201-EL | |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |