초음파 화상 진찰에 의하여 마우스에 있는 폐 종양 진행의 탐지
Summary
이 프로토콜은 초음파 화상 진찰에 의하여 형성된 종양의 정량화뿐만 아니라 마우스에 있는 KRAS 폐 종양을 유도하기 위하여 취한 단계를 기술합니다. 작은 종양은 B 선으로 초기 시간대에 시각화됩니다. 이후 시점에서 상대 종양 부피 측정은 초음파 소프트웨어의 측정 도구에 의해 달성됩니다.
Abstract
매년 160만 명의 피해자가 있는 폐암은 전 세계적으로 암의 부담에 크게 기여하고 있습니다. 폐암은 폐암 케이스의 ~ 25%를 구성하는 KRAS 종양유전자와 같은 종양 유전자에 있는 유전 변경에 의해 부분적으로 구동됩니다. KRAS 구동 폐암을 치료적으로 표적으로 하는 어려움은 부분적으로 실험실에 있는 질병의 진행을 모방할 수 있는 가난한 모형이 있기에서 유래합니다. 우리는 초음파 화상 진찰을 통해 Cre 유도성 LSL-KRAS G12D 마우스 모형에 있는 1 차적인 KRAS 폐 종양의 상대적인 정량화를 허용하는 방법을 기술합니다. 이 방법은 폐 자렌치의 밝기 (B) 모드 획득에 의존한다. 이 모형에서 처음에 형성되는 종양은 B 선으로 구상되고 취득한 심상에 있는 B 선의 수를 계수해서 정량화될 수 있습니다. 이들은 마우스 폐의 표면에 형성된 상대적인 종양 수를 나타낼 것이다. 형성된 종양이 시간이 지남에 따라 발전함에 따라 폐 실치내의 깊은 갈라짐으로 인식됩니다. 형성된 종양의 둘레가 잘 정의되기 때문에, 상대적인 종양 부피를 계산하는 것은 종양의 길이 및 폭을 측정하고 이를 종양 캘리퍼스 측정에 사용되는 공식에 적용함으로써 달성된다. 초음파 화상 진찰은 마우스에 있는 종양 정량화를 위해 수시로 이용되는 비침범성, 빠르고 사용자 친화적인 기술입니다. 비록 유물은 초음파 심상을 취득할 때 나타날 수 있더라도, 이 화상 진찰 기술은 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 화상 진찰과 같은 그밖 화상 진찰 기술에 비교된 마우스에 있는 종양 정량화를 위해 더 유리하다는 것을 보여주었습니다 생물 발광 이미징 (BLI). 연구원은 마우스의 다른 단 사이 폐 종양 개시 그리고 진행을 비교해서 이 기술을 사용하여 새로운 치료 표적을 조사할 수 있습니다.
Introduction
전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인으로, 폐암은 주로 실험실에서 질병을 재현 할 수있는 관련 전임상 모델의 부족으로 인해 치료에 불응성 남아있다1. 폐암 케이스의 약 25%는 KRAS 종양유전자2에있는 돌연변이 때문이. KRAS 구동 폐암은 수시로 이 질병에 있는 추가 연구 결과의 중요성을 강조하는 치료에 나쁜 예후 및 낮은 반응과 연관됩니다2.
KRAS 폐암 유발 면역유능한 마우스에서 폐종양 성장에 대한 상대적 평가를 실시간으로 할 수 있는 방법을 최적화하였다. 우리는 KRAS G12D 종양유전자가 Cre lentiviral 벡터3,4에의해 발현될 수 있는 록스 스톱 록스 KRAS G12D(LSL-KRAS G12D) 마우스를 사용합니다. 이들 벡터는 탄산 무수드라아제 2에 의해 구동되며, 바이러스 감염이 폐포 상피세포5에서특이적으로 일어날 수 있도록 한다. 또한, 폐 종양의 개시 및 진행을 가속화하기 위해, 렌티바이러스 구조체는 또한 U6/H1 프로모터로부터 P53 shRNA를 발현한다(본명 렌티바이러스구조는 Ca2Cre-shp53)로 지칭될 것이다 6. 이 방법의 생물학적 관련성은 마우스에서 비 정형 종양의 이종이식과 는 반대로 마우스에서 폐 종양 발달의 자연적인 과정에 있다. 정형외피 법을 이용한 장애물은 마우스를 희생시키지 않고 폐종양 성장을 모니터링하는 것입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 이 마우스 모델에서 2차원(2D) 모드에서 폐 종양 진행을 분석할 수 있도록 초음파 영상을 최적화했습니다. 감염 후 7 주에 종양을 시작하면 초음파 이미지에서 B 라인으로 반영되며, 이는 계산 될 수 있지만 폐에 존재하는 정확한 종양 수를 반영하지는 않습니다. B 라인은 폐 실치마7,8의흉막 선에서 발생하는 레이저와 같은 수직 흰색 라인을 특징으로합니다. 큰 종양은 감염의 18 주 후에 구상될 수 있습니다. 이 종양의 상대적인 부피는 초음파에 행해진 2D 측정에 의해 정량화됩니다.
이 방법은 LSL-KRAS G12D 마우스 모델에서 폐 종양 성장에 대한 약리학적 약물의 효과를 조사하는 연구진에게 최적입니다. 또한, 폐 종양 진행은 상이한 유전계를 가진 마우스 들 사이에서 비교될 수 있고, 폐 종양 부피의 발달에 대한 특정 유전자/단백질의 존재 또는 부재의 중요성을 조사한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 초음파에 의한 Cre-유도성 LSL-KRAS G12D 마우스 모델에서 폐 종양 성장을 평가할 수 있는 방법을 입증한다. 이 방법은 폐 종양 성장에 대한 약리학적 억제제의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 또한 다른 유전 배경의 마우스 사이 폐 종양 성장을 비교하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 특수 한 계산 기술이 필요하지 않지만, 다른 마우스 그룹을 비교하는 데 사…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
렌티바이러스 Ca2Cre-shp53 벡터에 대해 박사 I. Verma에게 감사드립니다. 이 연구는 캐나다 보건연구원(CIHR MOP 137113)에서 AEK에 대한 기금으로 지원되었습니다.
Materials
| 0.45 μm Acrodisc Syringe Filters | Pall Corporation | PN 4614 | |
| 100-mm Cell Cultre Plate | CELLSTAR | 664 160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657 160 | |
| Amicon Ultra – 15 Centrifugal Filter Units | Merck Millipore Ltd. | UFC910024 | |
| BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
| CA2Cre-shp53 lentiviral vector | From Dr. I Verma Laboratory | ||
| DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
| FBS | Multicell | 80450 | |
| LSL-KRASG12D mouse | JAX Mice | 8179 | |
| MX550S; Centre Transmit: 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
| OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
| Pen/strep | Multicell | 450-201-EL | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
| VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |
Referências
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