Ultrason Görüntüleme ile Farelerde Akciğer Tümörü İlerlemesinin Saptanması
Summary
Bu protokol, farelerde KRAS akciğer tümörlerini indüklemek için atılan adımları ve ultrason görüntüleme ile oluşan tümörlerin sayısallaştırılmasını açıklamaktadır. Küçük tümörler erken zaman noktalarında B-çizgileri olarak görselleştirilir. Daha sonraki zaman noktalarında ultrason yazılımında ölçüm aracı ile nispi tümör hacmi ölçümleri yapılır.
Abstract
Yılda ~ 1.6 milyon kurban ile, akciğer kanseri kanserin dünya çapında yüke muazzam katkıda bulunur. Akciğer kanseri kısmen kras onkogen gibi onkogenlerde genetik değişiklikler tarafından tahrik edilir, hangi akciğer kanseri vakalarının ~ 25% oluşturmaktadır. Terapötik KRAS güdümlü akciğer kanseri hedefleme zorluk kısmen laboratuvarda hastalığın ilerlemesini taklit edebilir kötü modellere sahip kaynaklanmaktadır. Biz ultrason görüntüleme ile Cre-indükleyici LSL-KRAS G12D fare modelinde primer KRAS akciğer tümörlerinin göreceli nicelik izin veren bir yöntem açıklayın. Bu yöntem, akciğer parankiminin parlaklık (B) modu edinimine dayanır. Başlangıçta bu modelde oluşan tümörler B-çizgileri olarak görselleştirilerek elde edilen görüntülerde bulunan B-çizgilerinin sayısı sayılarak ölçülebilir. Bunlar fare akciğer yüzeyinde oluşan göreceli tümör numarasını temsil eder. Oluşan tümörler zamanla geliştikçe, akciğer parankim içinde derin yarıklar olarak algılanır. Oluşan tümörün çevresi iyi tanımlanmış olduğundan, tümörün uzunluğu ve genişliği ölçülmesi ve tümör kaliper ölçümleri için kullanılan formülde uygulanması ile göreceli tümör hacminin hesaplanması sağlanır. Ultrason görüntüleme genellikle farelerde tümör nicelikleri için kullanılan non-invaziv, hızlı ve kullanıcı dostu bir tekniktir. Ultrason görüntüleri elde edilirken objeler ortaya çıksa da, bu görüntüleme tekniğinin farelerde tümör nicelikleri için bilgisayarlı tomografi (BT) görüntüleme ve biyolüminesans görüntüleme (BLI). Araştırmacılar, farklı fare grupları arasında akciğer tümörü inisiyasyonu ve ilerlemesini karşılaştırarak bu tekniği kullanarak yeni terapötik hedefleri araştırabilirler.
Introduction
Kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedeni olarak dünya çapında, akciğer kanseri tedavileri için refrakter kalır, özellikle laboratuvarda hastalığı özetleyebilir ilgili pre-klinik modellerin eksikliği nedeniyle1. Akciğer kanseri vakalarının yaklaşık %25’i KRAS onkogen2’dekimutasyonlara bağlıdır. KRAS güdümlü akciğer kanseri genellikle kötü prognoz ve tedaviye düşük yanıt ile ilişkilidir, Bu hastalıkta daha fazla çalışmanın önemini vurgulayarak2.
KRAS akciğer kanserine bağlı immün yetkİli farelerde akciğer tümörü büyümesinin gerçek zamanlı olarak değerlendirilmesini sağlayan bir yöntem optimize ettik. Biz Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) fareler hangi KRAS G12D onkogen Cre lentiviral vektörler3,4ile ifade edilebilir kullanın. Bu vektörler karbonik anhidraz tarafından tahrik edilir 2, viral enfeksiyon özellikle alveoler epitel hücrelerinde yer almak için izin5. Buna ek olarak, akciğer tümörlerinin başlatılması ve ilerlemesini hızlandırmak için, lentiviral yapı da bir U6/H1 organizatörü p53 shRNA ifade eder (burada lentiviral yapı Ca2Cre-shp53 olarak anılacaktır)6. Bu yöntemin biyolojik önemi farelerde ortotopik olmayan tümörlerin ksenogreftlerinin aksine farelerde akciğer tümörü gelişiminin doğal seyrinde yatmaktadır. Ortotopik yöntemi kullanan bir engel fareden ödün vermeden akciğer tümörü büyümesini izlemektir. Bu sınırlamayı aşmak için ultrason görüntülemeyi, bu fare modelinde iki boyutlu (2D) modda akciğer tümörü progresyonunun analizine izin vermek için optimize ettik. Enfeksiyon sonrası 7 hafta tümörlerin başlatılması ultrason görüntülerinde B-hatları olarak yansıtılır, hangi sayılabilir, ancak akciğerde mevcut tümörlerin tam sayısını yansıtmaz. B-hatları akciğer parankim7plevral çizgi kaynaklanan lazer benzeri dikey beyaz çizgiler ile karakterizedir7 ,8. Büyük tümörler 18 haftalık enfeksiyondan sonra görüntülenebilir. Bu tümörlerin göreceli hacmi ultrasonda yapılan 2B ölçümlerile ölçülür.
Bu yöntem, Farmakolojik ilaçların LSL-KRAS G12D fare modelinde akciğer tümörü büyümesi üzerine etkisini araştıran araştırmacılar için en uygun yöntemdir. Buna ek olarak, akciğer tümörü progresyonu farklı genetik soylara sahip fareler arasında karşılaştırılabilir, varlığı veya bazı genlerin yokluğu / proteinlerin varlığı veya yokluğu akciğer tümör hacminin gelişimi üzerinde incelenmesi için.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cre-indüklenebilir LSL-KRAS G12D fare modelinde akciğer tümörü büyümesini ultrason ile değerlendirebilen bir yöntem gösterdik. Bu yöntem farmakolojik inhibitörlerin akciğer tümörü büyümesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. Aynı zamanda farklı genetik geçmişe sahip fareler arasında akciğer tümörü büyümesini karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu tekniğin kullanılması özel hesaplama becerileri gerektirmez, ancak, yöntem farelerin farklı grupları karşıla?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz lentiviral Ca2Cre-shp53 vektör için Dr I. Verma teşekkür ederiz. Çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri’nden (CIHR MOP 137113) AEK’e yapılan fonlar tarafından desteklendi.
Materials
| 0.45 μm Acrodisc Syringe Filters | Pall Corporation | PN 4614 | |
| 100-mm Cell Cultre Plate | CELLSTAR | 664 160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657 160 | |
| Amicon Ultra – 15 Centrifugal Filter Units | Merck Millipore Ltd. | UFC910024 | |
| BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
| CA2Cre-shp53 lentiviral vector | From Dr. I Verma Laboratory | ||
| DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
| FBS | Multicell | 80450 | |
| LSL-KRASG12D mouse | JAX Mice | 8179 | |
| MX550S; Centre Transmit: 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
| OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
| Pen/strep | Multicell | 450-201-EL | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
| VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |
Referências
- Eisenstein, M. Personalized medicine: Special treatment. Nature. 513, 8 (2014).
- Karachaliou, N., et al. KRAS mutations in lung cancer. Clinical Lung Cancer. 14 (3), 205-214 (2013).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes & Development. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocol. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Chen, J., Lecuona, E., Briva, A., Welch, L. C., Sznajder, J. I. Carbonic anhydrase II and alveolar fluid reabsorption during hypercapnia. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 38 (1), 32-37 (2008).
- Xia, Y., et al. Reduced cell proliferation by IKK2 depletion in a mouse lung-cancer model. Nature Cell Biology. 17 (4), 532 (2015).
- Demi, L., et al. Determination of a potential quantitative measure of the state of the lung using lung ultrasound spectroscopy. Scientific Reports. 7, 12746 (2017).
- Mohanty, K., et al. Characterization of the Lung Parenchyma Using Ultrasound Multiple Scattering. Ultrasound in Medicine and Biology. 43, 993-1003 (2017).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Saraogi, A. Lung ultrasound: Present and future. Lung India. 32 (3), 250-257 (2015).
- Gargani, L., Volpicelli, G. How I do it: lung ultrasound. Cardiovascular Ultrasound. 12, 25 (2014).
- Soldati, G., et al. On the Physical Basis of Pulmonary Sonographic Interstitial Syndrome. Journal of Ultrasound in Medicine. 35 (10), 2975 (2016).
- Raes, F., et al. High-Resolution Ultrasound and Photoacoustic Imaging of Orthotopic Lung Cancer in Mice: New Perspectives for Onco-Pharmacology. PLoS One. 11 (4), 15 (2016).
- Lakshman, M., Needles, A. Screening and quantification of the tumor microenvironment with micro-ultrasound and photoacoustic imaging. Nature Methods. 12 (4), 372 (2015).
- Chichra, A., Makaryus, M., Chaudhri, P., Narasimhan, M. Ultrasound for the Pulmonary Consultant. Clinical Medicine Insights: Circulatory Respiratory and Pulmonary Medicine. 10, 9 (2016).
