Détection de la progression des tumeurs pulmonaires chez les souris par imagerie par ultrasons
Summary
Ce protocole décrit les étapes prises pour induire des tumeurs pulmonaires de KRAS chez les souris aussi bien que la quantification des tumeurs formées par l’imagerie d’ultrason. Les petites tumeurs sont visualisées dans les premiers temps comme des lignes B. À des moments plus tard, des mesures relatives de volume de tumeur sont réalisées par l’outil de mesure dans le logiciel d’ultrason.
Abstract
Avec 1,6 million de victimes par an, le cancer du poumon contribue énormément au fardeau mondial du cancer. Le cancer du poumon est en partie entraîné par des altérations génétiques chez les oncogènes tels que l’oncogène KRAS, qui représente environ 25 % des cas de cancer du poumon. La difficulté de cibler thérapeutiquement le cancer du poumon à base de KRAS provient en partie d’avoir de mauvais modèles qui peuvent imiter la progression de la maladie en laboratoire. Nous décrivons une méthode qui permet la quantification relative des tumeurs pulmonaires primaires de KRAS dans un modèle de souris DeL-KRAS G12D cre-inductible par l’intermédiaire de l’imagerie par ultrasons. Cette méthode repose sur l’acquisition de la luminosité (B)-mode du parenchyme pulmonaire. Les tumeurs qui sont initialement formées dans ce modèle sont visualisées comme des lignes B et peuvent être quantifiées en comptant le nombre de lignes B présentes dans les images acquises. Ceux-ci représenteraient le nombre relatif de tumeur formé sur la surface du poumon de souris. Pendant que les tumeurs formées se développent avec le temps, elles sont perçues comme fissures profondes dans le parenchyme de poumon. Puisque la circonférence de la tumeur formée est bien définie, le calcul du volume relatif de tumeur est réalisé en mesurant la longueur et la largeur de la tumeur et en les appliquant dans la formule utilisée pour des mesures de calibrage de tumeur. L’imagerie par ultrasons est une technique non invasive, rapide et conviviale qui est souvent utilisée pour les quantifications tumorales chez la souris. Bien que des artefacts puissent apparaître lors de l’obtention d’images à ultrasons, il a été démontré que cette technique d’imagerie est plus avantageuse pour les quantifications tumorales chez la souris que pour d’autres techniques d’imagerie telles que l’imagerie par tomodensitométrie (TDM) et l’imagerie par bioluminescence (BLI). Les chercheurs peuvent étudier de nouvelles cibles thérapeutiques en utilisant cette technique en comparant l’initiation et la progression des tumeurs pulmonaires entre différents groupes de souris.
Introduction
En tant que principale cause de décès liés au cancer dans le monde, le cancer du poumon reste réfractaire aux traitements, principalement en raison de l’absence de modèles précliniques pertinents qui peuvent récapituler la maladie en laboratoire1. Environ 25% des cas de cancer du poumon sont dus à des mutations dans l’oncogène KRAS2. Le cancer du poumon kraS-conduit est souvent associé au pronostic pauvre et à la basse réponse au traitement, soulignant l’importance de plus amples études dans cette maladie2.
Nous avons optimisé une méthode qui permet l’évaluation relative de la croissance de tumeur de poumon en temps réel dans les souris immunisées-compétentes cancer-induites de KRAS de CANCER- Nous utilisons des souris Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) dans lesquelles l’oncogène KRAS G12D peut être exprimé par les vecteurs lentiviraux Cre3,4. Ces vecteurs sont entraînés par l’anhydrase carbonique 2, permettant à l’infection virale de se produire spécifiquement dans les cellules épithéliales alvéolaires5. En outre, pour accélérer l’initiation et la progression des tumeurs pulmonaires, la construction lentiviral exprime également P53 shRNA d’un promoteur U6/H1 (la construction lentiviral ici sera dénommée Ca2Cre-shp53)6. La pertinence biologique de cette méthode réside dans le cours naturel du développement de tumeur pulmonaire chez les souris par opposition aux xénogreffes des tumeurs non orthotopiques chez les souris. Un obstacle utilisant la méthode orthotopic surveille la croissance de tumeur de poumon sans sacrifier la souris. Pour surmonter cette limitation, nous avons optimisé l’imagerie par ultrasons pour permettre l’analyse de la progression des tumeurs pulmonaires en mode bidimensionnel (2D) dans ce modèle de souris. Les tumeurs initiatrices à 7 semaines après l’infection sont reflétées comme B-lignes dans les images d’ultrason, qui peuvent être comptées, mais ne refléteront pas le nombre exact de tumeurs présentes sur le poumon. Les lignes B sont caractérisées par des lignes blanches verticales de laser provenant de la ligne pleurale dans le parenchyme pulmonaire7,8. Les grandes tumeurs peuvent être visualisées après 18 semaines d’infection. Le volume relatif de ces tumeurs est quantifié par des mesures 2D faites sur l’ultrason.
Cette méthode est optimale pour les chercheurs qui étudient l’effet des médicaments pharmacologiques sur la croissance des tumeurs pulmonaires dans le modèle de souris LSL-KRAS G12D. En outre, la progression de tumeur de poumon peut être comparée entre les souris avec différentes lignées génétiques, pour examiner l’importance de la présence ou de l’absence de certains gènes/protéines sur le développement du volume de tumeur de poumon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous démontrons une méthode qui peut évaluer la croissance de tumeur de poumon dans le modèle de souris de LSL-KRAS G12D de Cre-inductible par ultrason. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer l’effet des inhibiteurs pharmacologiques sur la croissance des tumeurs pulmonaires. Il peut également être utilisé pour comparer la croissance des tumeurs pulmonaires entre les souris de différents milieux génétiques. L’utilisation de cette technique ne nécessite pas de compétences informatiques spécialis…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr I. Verma pour le vecteur lentiviral Ca2Cre-shp53. Les travaux ont été appuyés par des fonds des Instituts de recherche en santé du Canada (BSI13) à l’AEK.
Materials
| 0.45 μm Acrodisc Syringe Filters | Pall Corporation | PN 4614 | |
| 100-mm Cell Cultre Plate | CELLSTAR | 664 160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657 160 | |
| Amicon Ultra – 15 Centrifugal Filter Units | Merck Millipore Ltd. | UFC910024 | |
| BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
| CA2Cre-shp53 lentiviral vector | From Dr. I Verma Laboratory | ||
| DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
| FBS | Multicell | 80450 | |
| LSL-KRASG12D mouse | JAX Mice | 8179 | |
| MX550S; Centre Transmit: 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
| OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
| Pen/strep | Multicell | 450-201-EL | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
| VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |
Referências
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