Detección de la progresión del tumor pulmonar en ratones por imágenes por ultrasonido
Summary
Este protocolo describe las medidas tomadas para inducir tumores pulmonares KRAS en ratones, así como la cuantificación de tumores formados por imágenes por ultrasonido. Los tumores pequeños se visualizan en los primeros puntos de tiempo como líneas B. En momentos posteriores, las mediciones relativas del volumen del tumor se logran mediante la herramienta de medición en el software de ultrasonido.
Abstract
Con 1,6 millones de víctimas al año, el cáncer de pulmón contribuye enormemente a la carga mundial del cáncer. El cáncer de pulmón es en parte impulsado por alteraciones genéticas en oncogenes como el oncogene KRAS, que constituye el 25% de los casos de cáncer de pulmón. La dificultad para atacar terapéuticamente el cáncer de pulmón impulsado por KRAS se debe en parte a tener modelos deficientes que pueden imitar la progresión de la enfermedad en el laboratorio. Describimos un método que permite la cuantificación relativa de tumores pulmonares KRAS primarios en un modelo de ratón LSL-KRAS G12D inducible Cre a través de imágenes por ultrasonido. Este método se basa en la adquisición en modo de brillo (B) del parénquima pulmonar. Los tumores que se forman inicialmente en este modelo se visualizan como líneas B y se pueden cuantificar contando el número de líneas B presentes en las imágenes adquiridas. Estos representarían el número de tumor relativo formado en la superficie del pulmón del ratón. A medida que los tumores formados se desarrollan con el tiempo, se perciben como hendiduras profundas dentro del parénquima pulmonar. Dado que la circunferencia del tumor formado está bien definida, el cálculo del volumen del tumor relativo se logra midiendo la longitud y anchura del tumor y aplicándolos en la fórmula utilizada para las mediciones de la pinza tumoral. Las imágenes por ultrasonido son una técnica no invasiva, rápida y fácil de usar que se utiliza a menudo para cuantificaciones tumorales en ratones. Aunque pueden aparecer artefactos al obtener imágenes de ultrasonido, se ha demostrado que esta técnica de diagnóstico por imágenes es más ventajosa para las cuantificaciones tumorales en ratones en comparación con otras técnicas de diagnóstico por imágenes, como la tomografía computarizada (TC) y la toma de imágenes imágenes de bioluminiscencia (BLI). Los investigadores pueden investigar nuevas dianas terapéuticas utilizando esta técnica comparando la iniciación y progresión del tumor pulmonar entre diferentes grupos de ratones.
Introduction
Como la principal causa de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo, el cáncer de pulmón sigue siendo refractario a los tratamientos, principalmente debido a la falta de modelos preclínicos relevantes que puedan recapitular la enfermedad en el laboratorio1. Alrededor del 25% de los casos de cáncer de pulmón se deben a mutaciones en el oncogeno KRAS2. El cáncer de pulmón impulsado por KRAS a menudo se asocia con un mal pronóstico y una baja respuesta a la terapia, lo que pone de relieve la importancia de seguir estudios en esta enfermedad2.
Optimizamos un método que permite la evaluación relativa del crecimiento del tumor pulmonar en tiempo real en ratones inmuno-competentes inducidos por el cáncer de pulmón KRAS. Utilizamos ratones Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) en los que el oncogene KRAS G12D puede ser expresado por vectores lentivirales Cre3,4. Estos vectores son impulsados por la anhidrasa carbónica 2, permitiendo que la infección viral tenga lugar específicamente en las células epiteliales alveolares5. Además, para acelerar la iniciación y progresión de los tumores pulmonares, la construcción lentiviral también expresa el ARNS P53 de un promotor U6/H1 (la construcción lentiviral aquí se denominará Ca2Cre-shp53)6. La relevancia biológica de este método radica en el curso natural del desarrollo de tumores pulmonares en ratones en comparación con los xenoinjertos de tumores no ortotópicos en ratones. Un obstáculo que utiliza el método ortotópico es controlar el crecimiento del tumor pulmonar sin sacrificar el ratón. Para superar esta limitación, optimizamos las imágenes por ultrasonido para permitir el análisis de la progresión del tumor pulmonar en modo bidimensional (2D) en este modelo de ratón. La iniciación de tumores a las 7 semanas después de la infección se refleja como líneas B en imágenes de ultrasonido, que se pueden contar, pero no reflejará el número exacto de tumores presentes en el pulmón. Las líneas B se caracterizan por líneas blancas verticales similares al láser que surgen de la línea pleural en el parénquima pulmonar7,8. Los tumores grandes se pueden visualizar después de 18 semanas de infección. El volumen relativo de estos tumores se cuantifica mediante mediciones 2D realizadas en ultrasonido.
Este método es óptimo para los investigadores que investigan el efecto de los medicamentos farmacológicos en el crecimiento del tumor pulmonar en el modelo de ratón LSL-KRAS G12D. Además, la progresión del tumor pulmonar se puede comparar entre ratones con diferentes linajes genéticos, para examinar la importancia de la presencia o ausencia de ciertos genes/proteínas en el desarrollo del volumen del tumor pulmonar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Demostramos un método que puede evaluar el crecimiento del tumor pulmonar en el modelo de ratón LSL-KRAS G12D inducible Cre por ultrasonido. Este método se puede utilizar para evaluar el efecto de los inhibidores farmacológicos en el crecimiento del tumor pulmonar. También se puede utilizar para comparar el crecimiento de tumores pulmonares entre ratones de diferentes orígenes genéticos. El uso de esta técnica no requiere habilidades computacionales especializadas, sin embargo, es importante ser sistemático en e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. I. Verma por el vector lentiviral Ca2Cre-shp53. El trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR MOP 137113) a AEK.
Materials
| 0.45 μm Acrodisc Syringe Filters | Pall Corporation | PN 4614 | |
| 100-mm Cell Cultre Plate | CELLSTAR | 664 160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657 160 | |
| Amicon Ultra – 15 Centrifugal Filter Units | Merck Millipore Ltd. | UFC910024 | |
| BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
| CA2Cre-shp53 lentiviral vector | From Dr. I Verma Laboratory | ||
| DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
| FBS | Multicell | 80450 | |
| LSL-KRASG12D mouse | JAX Mice | 8179 | |
| MX550S; Centre Transmit: 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
| OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
| Pen/strep | Multicell | 450-201-EL | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
| VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |
Referências
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