Påvisning av lungetumorprogresjon hos mus ved ultralydavbildning
Summary
Denne protokollen beskriver trinnene som er tatt for å indusere KRAS lungesvulster hos mus, samt kvantifisering av dannede svulster ved ultralydavbildning. Små svulster visualiseres i tidlige tidspunkter som B-linjer. Ved senere tidspunktoppnås relative tumorvolummålinger ved hjelp av måleverktøyet i ultralydprogramvaren.
Abstract
Med ~ 1,6 millioner ofre per år, lungekreft bidrar enormt til den verdensomspennende byrden av kreft. Lungekreft er delvis drevet av genetiske endringer i onkogenes som KRAS oncogene, som utgjør ~ 25% av lungekreft tilfeller. Vanskeligheten med terapeutisk målretting KRAS-drevet lungekreft stammer delvis fra å ha dårlige modeller som kan etterligne utviklingen av sykdommen i laboratoriet. Vi beskriver en metode som tillater relativ kvantifisering av primære KRAS lungesvulster i en Cre-inducible LSL-KRAS G12D musemodell via ultralydavbildning. Denne metoden er avhengig av lysstyrke (B)-modus oppkjøp av lungeparenchyma. Svulster som opprinnelig dannes i denne modellen visualiseres som B-linjer og kan kvantifiseres ved å telle antall B-linjer som finnes i de oppkjøpte bildene. Disse ville representere det relative tumornummeret dannet på overflaten av muslungen. Etter hvert som de dannede svulstene utvikler seg med tiden, oppfattes de som dype kløfter i lungeparenchyma. Siden omkretsen av den dannede svulsten er godt definert, oppnås beregning av det relative tumorvolumet ved å måle lengden og bredden på svulsten og bruke dem i formelen som brukes til tumorkalipermålinger. Ultralydavbildning er en ikke-invasiv, rask og brukervennlig teknikk som ofte brukes til tumorkvantifiseringer hos mus. Selv om artefakter kan oppstå når du får ultralydbilder, har det vist seg at denne bildeteknikken er mer fordelaktig for tumorkvantifiseringer hos mus sammenlignet med andre bildeteknikker som computertomografi (CT) avbildning og bioluminescensavbildning (BLI). Forskere kan undersøke nye terapeutiske mål ved hjelp av denne teknikken ved å sammenligne lungetumorinitiering og progresjon mellom ulike grupper av mus.
Introduction
Som den ledende årsaken til kreftrelaterte dødsfall over hele verden, lungekreft forblir ildfast mot behandlinger, hovedsakelig på grunn av mangel på relevante prekliniske modeller som kan rekapitulere sykdommen i laboratoriet1. Rundt 25% av lungekrefttilfeller skyldes mutasjoner i KRAS oncogene2. KRAS-drevet lungekreft er ofte forbundet med dårlig prognose og lav respons på terapi, og fremhever viktigheten av videre studier i denne sykdommen2.
Vi optimaliserte en metode som tillater den relative evalueringen av lungetumorvekst i sanntid hos KRAS lungekreftinduserte immunkompetente mus. Vi bruker Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) mus der KRAS G12D onkogen kan uttrykkes av Cre lentivirale vektorer3,4. Disse vektorene er drevet av karbonanhydrase 2, slik at virusinfeksjonen kan finne sted spesielt i alveolær epitelceller5. I tillegg, for å akselerere initiering og progresjon av lungesvulster, uttrykker lentiviral konstruksjon også P53 shRNA fra en U6/H1-promotor (lentiviral konstruksjon en gang vil bli referert til som Ca2Cre-shp53)6. Den biologiske relevansen av denne metoden ligger i det naturlige løpet av lungetumorutvikling hos mus i motsetning til xenografts av ikke-ortopiske svulster hos mus. Et hinder ved hjelp av ortopisk metode overvåker lungetumorvekst uten å ofre musen. For å overvinne denne begrensningen optimaliserte vi ultralydavbildning for å tillate analyse av lungetumorprogresjon i todimensjonal (2D) modus i denne musemodellen. Initiering av svulster ved 7 uker etter infeksjon gjenspeiles som B-linjer i ultralydbilder, som kan telles, men vil ikke gjenspeile det nøyaktige antallet svulster som finnes på lungene. B-linjer er preget av laserlignende vertikale hvite linjer som oppstår fra pleural linjen i lungeparenchyma7,8. Store svulster kan visualiseres etter 18 ukers infeksjon. Det relative volumet av disse svulstene kvantifiseres av 2D-målinger gjort på ultralyd.
Denne metoden er optimal for forskere som undersøker effekten av farmakologiske legemidler på lungetumorvekst i LSL-KRAS G12D-musemodellen. I tillegg kan lungetumorprogresjon sammenlignes mellom mus med forskjellige genetiske linjer, for å undersøke viktigheten av tilstedeværelse eller fravær av visse gener/ proteiner på utviklingen av lungetumorvolum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi viser en metode som kan vurdere lungetumorvekst i cre-inducible LSL-KRAS G12D musemodell ved ultralyd. Denne metoden kan brukes til å evaluere effekten av farmakologiske hemmere på lungetumorvekst. Den kan også brukes til å sammenligne lungetumorvekst mellom mus med forskjellig genetisk bakgrunn. Ved hjelp av denne teknikken krever ikke spesialiserte beregningsferdigheter, er det imidlertid viktig å være systematisk i antall rammer som brukes til analyse for å tillate riktig sammenligning hvis metoden brukes ti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. I. Verma for den lentivirale Ca2Cre-shp53 vektoren. Arbeidet ble støttet av midler fra Canadian Institutes of Health Research (CIHR MOP 137113) til AEK.
Materials
| 0.45 μm Acrodisc Syringe Filters | Pall Corporation | PN 4614 | |
| 100-mm Cell Cultre Plate | CELLSTAR | 664 160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657 160 | |
| Amicon Ultra – 15 Centrifugal Filter Units | Merck Millipore Ltd. | UFC910024 | |
| BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
| CA2Cre-shp53 lentiviral vector | From Dr. I Verma Laboratory | ||
| DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
| FBS | Multicell | 80450 | |
| LSL-KRASG12D mouse | JAX Mice | 8179 | |
| MX550S; Centre Transmit: 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
| OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
| Pen/strep | Multicell | 450-201-EL | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
| VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |
Referências
- Eisenstein, M. Personalized medicine: Special treatment. Nature. 513, 8 (2014).
- Karachaliou, N., et al. KRAS mutations in lung cancer. Clinical Lung Cancer. 14 (3), 205-214 (2013).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes & Development. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocol. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Chen, J., Lecuona, E., Briva, A., Welch, L. C., Sznajder, J. I. Carbonic anhydrase II and alveolar fluid reabsorption during hypercapnia. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 38 (1), 32-37 (2008).
- Xia, Y., et al. Reduced cell proliferation by IKK2 depletion in a mouse lung-cancer model. Nature Cell Biology. 17 (4), 532 (2015).
- Demi, L., et al. Determination of a potential quantitative measure of the state of the lung using lung ultrasound spectroscopy. Scientific Reports. 7, 12746 (2017).
- Mohanty, K., et al. Characterization of the Lung Parenchyma Using Ultrasound Multiple Scattering. Ultrasound in Medicine and Biology. 43, 993-1003 (2017).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Saraogi, A. Lung ultrasound: Present and future. Lung India. 32 (3), 250-257 (2015).
- Gargani, L., Volpicelli, G. How I do it: lung ultrasound. Cardiovascular Ultrasound. 12, 25 (2014).
- Soldati, G., et al. On the Physical Basis of Pulmonary Sonographic Interstitial Syndrome. Journal of Ultrasound in Medicine. 35 (10), 2975 (2016).
- Raes, F., et al. High-Resolution Ultrasound and Photoacoustic Imaging of Orthotopic Lung Cancer in Mice: New Perspectives for Onco-Pharmacology. PLoS One. 11 (4), 15 (2016).
- Lakshman, M., Needles, A. Screening and quantification of the tumor microenvironment with micro-ultrasound and photoacoustic imaging. Nature Methods. 12 (4), 372 (2015).
- Chichra, A., Makaryus, M., Chaudhri, P., Narasimhan, M. Ultrasound for the Pulmonary Consultant. Clinical Medicine Insights: Circulatory Respiratory and Pulmonary Medicine. 10, 9 (2016).
