Leisten-Subkutanes weißes Adiposeengewebe (ISWAT) Transplantationsmodell von Murine-Inseln
Summary
In diesem Protokoll wird eine Methode der murinen Islet-Isolierung und Transplantation in das inguinale subkutane weiße Fettgewebe beschrieben. Isolierte syngene murinische Inselchen werden mit einem Kellermembranhydrogel in einen murinen Empfänger transplantiert. Der Blutzuckerspiegel der Empfänger wird überwacht und die Histologieanalyse der Islettransplantate durchgeführt.
Abstract
Die Pankreas-Islet-Transplantation ist eine etablierte therapeutische Behandlung für Typ-1-Diabetes. Die Nierenkapsel ist die am häufigsten verwendete Stelle für die Letentransplantation in Nagetiermodellen. Die enge Nierenkapsel begrenzt jedoch die Transplantation ausreichender Inselchen bei großen Tieren und Menschen. Das inguinale subkutane weiße Fettgewebe (ISWAT), ein neuer subkutaner Raum, wurde als potenziell wertvoller Ort für die Zelltransplantation gefunden. Diese Seite hat eine bessere Blutversorgung als andere subkutane Räume. Darüber hinaus beherbergt die ISWAT eine größere Isletmasse als die Nierenkapsel, und die Transplantation in sie ist einfach. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren der Isolierung und Transplantation von Mausinselaufderungen in der ISWAT-Site von syngenen diabetischen Mausempfängern. Mit diesem Protokoll wurden murine Pankreasinseln durch Standard-Kollagennase-Verdauung isoliert und ein Kellermembran-Matrix-Hydrogel wurde zur Befestigung der gereinigten Inselchen am ISWAT-Standort verwendet. Der Blutzuckerspiegel der Empfängermäuse wurde mehr als 100 Tage lang überwacht. Islet-Transplantate wurden am Tag 100 nach der Transplantation zur histologischen Analyse geborgen. Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll für die Letentransplantation an der ISWAT-Site ist einfach und effektiv.
Introduction
Die weltweite Inzidenz und Prävalenz von Typ-1-Diabetes mellitus (T1DM) steigt laut den statistischen Daten der International Diabetes Federation (IDF)1schnell an. Die Islet-Transplantation ist einer der vielversprechendsten Ansätze zur Behandlung von T1DM4. Seit der große Durchbruch in der klinischen Islet-Transplantation mit dem Edmonton-Protokoll2 berichtet wurde, erreicht das funktionierende Islet-Transplantat-Überleben bei T1DM-Empfängern nach 5 Jahren nun etwa 50%3.
In der Vergangenheit wurden mehrere Transplantationsstellen, wie Leber, Nierenkapsel, Milz, intramuskuläre Region, subkutaner Raum, Knochenmark und Omentalbeutel für experimentelle IsletTransplantation5,6,7untersucht. Einige der oben genannten Seiten wurden in klinischen Einstellungen getestet8. Obwohl die Letentransplantation in die Leber die am weitesten verbreitete Methode in der klinischen Anwendung derzeit9bleibt, gibt es mehrere wichtige Probleme bei der Verwendung dieser Website zu beheben. Zum Beispiel, wie man den frühen Verlust der transplantierten Inselchen durch die sofortige blutvermittelte Entzündungsreaktion (IBMIR) und schlechte Sauerstoffversorgung10,11 und wie man die Insel transplantiert, wenn nötig, zu reduzieren, weil sie diffus in der Leber lokalisieren. Die Nierenkapsel kann ein idealer Ort für Nagetier-Empfänger sein. Die enge Nierenkapsel begrenzt jedoch die Transplantation ausreichender allogener Inselchen beim Menschen, obwohl sie aufgrund der hochgereinigten Poreninselpräparate, die klinisch verwendet werden, besser für die Inselxenotransplantation geeignet seinkann. Daher ist die Suche nach einem geeigneteren Standort für die Letentransplantation im Gange.
Der subkutane Raum kann aufgrund seiner Zugänglichkeit als klinisch anwendbarer Standort für die Letentransplantation genutzt werden. Allerdings ist die Effizienz der Inseltransplantation in den subkutanen Raum extrem gering, so dass eine relativ große Anzahl von Inselchen erforderlich ist, um Hyperglykämie umzukehren13. Kürzlich fand ein japanisches Forscherteam die ISWAT, eine neuartige subkutane Stelle, die für die Letentransplantation in einem murinen Modell im Vergleich zur Leber14überlegen ist. Die ISWAT enthält die epigastrische Arterie und Vene, so dass die reiche Blutversorgung kann Islet Transplantat Revaskularisation gewährleisten. In diesem Manuskript schlagen wir eine einfache Implantationsmethode mit einem Kellermembran-Matrix-Hydrogel vor, um syngene murinische Inselchen im ISWAT zu fixieren. Dieses Protokoll erweist sich als wirksam für die Letentransplantation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Pankreas-Islet-Transplantation ist eine vielversprechende Therapie zur Behandlung von T1DM. Die Wirkung dieser Therapie wird von vielen Faktoren beeinflusst und die Wahl eines optimalen Ortes für die Implantation von Isleten ist äußerst wichtig. Die ideale anatomische Stelle für die Letentransplantation sollte folgende Merkmale aufweisen: Zugänglichkeit für einfache Transplantationen, Biopsie n- und Transplantatentnahmeverfahren; reduzierte Komplikationen; hohe Erfolgsrate der Blutzuckerkontrolle; und langfrist…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Key F&D Program of China (2017YFC1103704)Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangdong Province (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZXJ2018059), Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province of China (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).
Materials
| 0.22 μm Syringe-driven Filter Unit | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL Pasteur pipette | JingAn Biological, China | J00085 | |
| 5 mL syringe | Szboon, China | 20170829 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 5-0 surgical suture | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
| 60 mL syringe | Szboon, China | 20170623 | |
| 75% Ethanol | LIRCON, China | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilution (1:200) |
| anti-mouse Glucagon antibody | Abcam | ab10988 | Dilution (1:100) |
| anti-mouse insulin antibody | Cell Signaling Technology | 3014s | Dilution (1:100) |
| blunt-pointed perfusion needle | Oloey, China | 005 | 32G, yellow |
| BSA | Meilune, China | MB4219 | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | 8~10 weeks | |
| cell culture dish | BIOFIL, China | TCD000100 | General,Non-treated,87.8 mm diameter |
| centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
| cephalosporin | Lukang medical, China | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
| collagenase Type V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| D-hank's buffer | Coolaber, China | PM5140-10 | |
| dithizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| fluorescein diacetate (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| fluorescent microscope | Leica | DMIL | |
| gel-loading pipet tips | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Iodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
| light-tight culture dish | DVS, China | AN-5058548 | self-made, glass dish sprayed with black paint |
| Medical Adhesive Tape | Cofoe, China | K12001 | |
| non-invasive microtweezers | RWD Life Science | F11033-11 and F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| ophthalmic scissors | RWD Life Science | S12012-12 and S11001-08 | |
| P/S (penicillin / streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (streptozotocin) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Test Strip | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilution (1:200) |
| vascular clamp | RWD Life Science | R31006-04 |
Referências
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