뮤린 아일렛의 인과 피하 백색 지방 조직 (ISWAT) 이식 모형
Summary
이 프로토콜에서, 뮤린 아일렛 분리 및 인추니얼 피하 백색 지방 조직내로이식하는 방법이 기재되어 있다. 분리된 합성 뮤린 섬은 지하 막 하이드로겔을 사용하여 뮤린 수용자로 이식된다. 수령인의 혈당 수준을 모니터링하고, 아일렛 이식의 학력 분석이 수행됩니다.
Abstract
췌도 이식은 타입-1 당뇨병을 위한 잘 확립된 치료 처리입니다. 신장 캡슐은 설치류 모형에 있는 아일레 이식을 위해 일반적으로 이용되는 사이트입니다. 그러나, 단단한 신장 캡슐은 큰 동물 및 인간에 있는 충분한 작은 작은 것의 이식을 제한합니다. 새로운 피하 공간인 인큐니얼 피하 백색 지방 조직(ISWAT)은 저도 이식에 잠재적으로 귀중한 부위인 것으로 나타났습니다. 이 사이트는 다른 피하 공간보다 더 나은 혈액 공급이 있습니다. 더욱이, ISWAT는 신장 캡슐보다 더 큰 작은 덩어리를 수용하고, 그것으로 이식하는 것은 간단하다. 이 원고는 합성 당뇨병 마우스 수용자의 ISWAT 부위에서 마우스 췌도 격리 및 이식의 절차를 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 뮤린 췌도는 표준 콜라게나아제 소화에 의해 분리되었고 지하 막 매트릭스 하이드로겔은 ISWAT 부위에서 정제된 섬을 고정하는데 사용되었다. 수용자 마우스의 혈당 수준을 100일 이상 모니터링하였다. 아일렛 이식편은 조직학적 분석을 위해 이식 후 100일째에 회수되었다. 이 원고에 설명된 ISWAT 사이트에서 의정서는 간단하고 효과적이다.
Introduction
국제 당뇨병 연맹 (IDF)1의통계 데이터에 따르면 타입-1 당뇨병 (T1DM)의 세계적인 부각 그리고 보급은 급속하게 상승하고 있습니다. 아일렛 이식은 T1DM4를 치료하기위한 가장 유망한 접근 법 중 하나입니다. 에드먼튼 프로토콜2를 이용한 임상 섬 이식에서 큰 돌파구가 보고된 이후, 5년 후 T1DM 수혜자에서 기능하는 섬 이식 생존은 이제 약 50%3에도달한다.
과거에는 간, 신장 캡슐, 비장, 근육 내 부위, 피하 공간, 골수 및 오멘탈 파우치와 같은 여러 이식 부위가 실험적인 췌도이식을위해 탐구되었다5,6,7. 위의 사이트 중 일부는 임상 설정에서 테스트 되었습니다8. 췌도 이식은 현재9에서임상 적용에서 가장 널리 사용되는 방법으로 남아 있지만,이 사이트를 사용할 때 해결해야 할 몇 가지 중요한 문제가 있습니다. 예를 들어, 즉각적인 혈액 매개 염증 반응(IBMIR)과 가난한 산소화공급(10,11)에 의해 야기된 이식된 작은 섬들의 조기 손실을 감소시키는 방법및필요한 경우 췌도 이식편을 회수하는 방법, 그들은 간에서 확산되기 때문에. 신장 캡슐 설치류 수용자에 대 한 이상적인 사이트 수 있습니다. 그러나, 단단한 신장 캡슐은 인간에서 충분한 동종 아일렛의 이식을 제한하지만, 고도로 정제된 돼지 섬 제제로 인해 아일트종이식에 더 적합할 수 있지만 임상적으로5,12. 따라서, 아일렛 이식에 적합한 부위에 대한 탐색이 진행되고 있다.
피하 공간은 접근성으로 인해 아일렛 이식에 임상적으로 적용 가능한 부위로서 사용될 수 있다. 그러나, 피하 공간으로의 섬 이식의 효율은 매우 낮으며, 따라서고혈당증(13)을역전시키기 위해 상대적으로 많은 수의 섬을 필요로 한다. 최근 일본의 한 연구팀은간(14)과비교했을 때 뮤린 모델에서 췌도 이식에 우수한 새로운 피하 부위인 ISWAT를 발견했다. ISWAT는 상복부 동맥과 정맥을 포함하므로 풍부한 혈액 공급은 아일렛 이식편 재혈관화를 보장 할 수 있습니다. 이 원고에서는 ISWAT에서 합성 뮤린 섬을 고정하기 위해 지하 막 매트릭스 하이드로겔을 사용하여 쉬운 이식 방법을 제안합니다. 이 프로토콜은 아일렛 이식에 효과적임을 증명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
췌장 췌도 이식은 T1DM을 치료하는 유망한 치료법입니다. 이 치료의 효과는 많은 요인에 의해 영향을 받고 아일렛 이식을위한 최적의 부위를 선택하는 것은 매우 중요합니다. 아일렛 이식에 대한 이상적인 해부학 적 부위는 다음과 같은 특성을 가져야합니다 : 간단한 이식, 생검 및 이식 편이식 검색 절차에 대한 접근성; 감소 합병증; 혈액 포도 당 제어의 높은 성공률; 및 섬 이식편15,<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 사업은 중국 의전사업(2017YFC1103704)의 국고병원 건립을 위한 특별기금(2019), 심천의학산명프로젝트(SZSM201412020), 고급기금의 보조금으로 지원되었다. 심천의 의료 분야 건설 (2016031638), 심천 과학 기술 재단 (JCJY2022229204849975, GJHZ2017031417135556), 심천 재단 건강 및 가족 계획위원회 (SZXJ20102111S222222 중국 광동성 과학 연구 재단 (A2019218), 중국 박사 후 과학 재단 (2018M633218).
Materials
| 0.22 μm Syringe-driven Filter Unit | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL Pasteur pipette | JingAn Biological, China | J00085 | |
| 5 mL syringe | Szboon, China | 20170829 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 5-0 surgical suture | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
| 60 mL syringe | Szboon, China | 20170623 | |
| 75% Ethanol | LIRCON, China | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilution (1:200) |
| anti-mouse Glucagon antibody | Abcam | ab10988 | Dilution (1:100) |
| anti-mouse insulin antibody | Cell Signaling Technology | 3014s | Dilution (1:100) |
| blunt-pointed perfusion needle | Oloey, China | 005 | 32G, yellow |
| BSA | Meilune, China | MB4219 | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | 8~10 weeks | |
| cell culture dish | BIOFIL, China | TCD000100 | General,Non-treated,87.8 mm diameter |
| centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
| cephalosporin | Lukang medical, China | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
| collagenase Type V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| D-hank's buffer | Coolaber, China | PM5140-10 | |
| dithizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| fluorescein diacetate (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| fluorescent microscope | Leica | DMIL | |
| gel-loading pipet tips | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Iodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
| light-tight culture dish | DVS, China | AN-5058548 | self-made, glass dish sprayed with black paint |
| Medical Adhesive Tape | Cofoe, China | K12001 | |
| non-invasive microtweezers | RWD Life Science | F11033-11 and F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| ophthalmic scissors | RWD Life Science | S12012-12 and S11001-08 | |
| P/S (penicillin / streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (streptozotocin) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Test Strip | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilution (1:200) |
| vascular clamp | RWD Life Science | R31006-04 |
Referências
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