Inguinal Subkutan Beyaz Yağ Dokusu (ISWAT) Transplantasyon Modeli Murine Adacıkları
Summary
Bu protokolde inguinal subkutan beyaz yağ dokusuna murine adacık izolasyonu ve transplantasyon yöntemi tanımlanmıştır. İzole syngeneic murine adacıkları bir murine alıcı içine bir bodrum membran hidrojel kullanılarak nakledilir. Alıcıların kan şekeri düzeyi izlenir ve adacık greftlerinin histoloji analizi yapılır.
Abstract
Pankreas adacık nakli tip 1 diyabet için köklü bir tedavi yöntemidir. Böbrek kapsülü kemirgen modellerinde adacık nakli için en sık kullanılan yerdir. Ancak, sıkı böbrek kapsülü büyük hayvanlarda ve insanlarda yeterli adacıkların naklini sınırlar. Yeni bir deri altı alan olan inguinal subkutan beyaz yağ dokusunun (ISWAT) adacık nakli için potansiyel olarak değerli bir yer olduğu bulunmuştur. Bu site diğer deri altı alanlarda daha iyi kan akımı vardır. Ayrıca, ISWAT böbrek kapsülü daha büyük bir adacık kütlesi barındırır, ve içine nakli basittir. Bu makale, sinjenik diyabetik fare alıcılarının ISWAT bölgesinde fare adacık izolasyonu ve transplantasyon prosedürünü açıklamaktadır. Bu protokol kullanılarak, murine pankreas adacıkları standart kollajenaz sindirim tarafından izole edildi ve bir bazal membran matris hidrojel ISWAT sitesinde safamına adacıklar sabitleme için kullanılmıştır. Alıcı farelerin kan şekeri düzeyleri 100 günden fazla izlendi. Adacık greftleri histolojik analiz için transplantasyon dan sonra 100. Bu el yazmasında açıklanan ISWAT sitesinde adacık nakli protokolü basit ve etkilidir.
Introduction
Uluslararası Diyabet Federasyonu (IDF)1istatistiksel verilerine göre, tip 1 diabetes mellitus (T1DM) dünya çapında insidansı ve yaygınlığı hızla artmaktadır. Adacık transplantasyonu T1DM4tedavisinde en umut verici yaklaşımlardan biridir. Edmonton protokolü2 kullanılarak klinik adacık transplantasyonunda yapılan büyük atılım rapor edildiğinden, 5 yıl sonra T1DM alıcılarında adacık grefti sağkalım günümüzde yaklaşık %50’ye 3’e ulaşmaktadır.
Geçmişte deneysel adacık nakli için karaciğer, böbrek kapsülü, dalak, kas içi bölge, deri altı alan, kemik iliği ve omental kese gibi çeşitli transplantasyon bölgeleri incelenmiştir5,6,7. Yukarıdaki sitelerin bazıları klinik ortamlarda test edilmiştir8. Karaciğeriçine adacık nakli şu anda klinik uygulamada en yaygın kullanılan yöntem olmaya devam etmesine rağmen9, Bu siteyi kullanırken ele alınması gereken birkaç önemli sorunlar vardır. Örneğin, anlık kan aracılı inflamatuar reaksiyon (IBMIR) ve kötü oksijenasyon kaynağı10,11 ve nasıl gerekirse adacık greftleri almak için neden nakledilen adacıkların erken kaybını azaltmak için nasıl, onlar yaygın karaciğerde lokalize çünkü. Böbrek kapsülü kemirgen alıcıları için ideal bir yer olabilir. Ancak, sıkı böbrek kapsülü insanlarda yeterli allojenik adacıkların nakli sınırlar, klinik olarak kullanılan yüksek saflaştırılmış domuz adacık preparatları nedeniyle adacık ksenotransplantasyon için daha iyi bir uyum olabilir rağmen5,12. Bu nedenle adacık nakli için daha uygun bir alan arayışı devam etmektedir.
Deri altı alan erişilebilirliği nedeniyle adacık nakli için klinik olarak uygulanabilir bir alan olarak kullanılabilir. Ancak, subkutan alana adacık nakli verimliliği son derece düşüktür, böylece hiperglisemi ters adacıkların nispeten çok sayıda gerektiren13. Son zamanlarda, bir Japon araştırma ekibi ISWAT bulundu, karaciğer ile karşılaştırıldığında bir murine modelinde adacık nakli için üstün yeni bir deri altı site14. ISWAT epigastrik arter ve ven içerir, bu nedenle zengin kan akımı adacık greft revaskülarizasyon sağlayabilir. Bu yazıda, ISWAT’taki singenik murine adacıklarını onarmak için bir bodrum membran matris hidrojeli kullanılarak kolay bir implantasyon yöntemi öneriyoruz. Bu protokol adacık nakli için etkili olduğunu kanıtlıyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pankreas adacık nakli T1DM tedavisi için umut verici bir tedavi yöntemidir. Bu tedavinin etkisi birçok faktörden etkilenir ve adacık implantasyonu için en uygun yeri seçmek son derece önemlidir. Adacık transplantasyonu için ideal anatomik alan aşağıdaki özelliklere sahip olmalıdır: basit transplantasyon, biyopsi ve greft alma işlemleri için erişilebilirlik; azaltılmış komplikasyonlar; kan şekeri kontrolünün yüksek başarı oranı; ve adacık greftlerinin uzun süreli hayatta kalma<sup class="xr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Temel Ar-Ge Programı (2017YFC1103704)Guangdong Eyaleti Yüksek Düzeyli Hastanelerin İnşaatı Için Özel Fonlar (2019), Shenzhen’deki Sanming Tıp Projesi (SZSM201412020), Yüksek Seviye Fonu’ndan gelen hibelerle desteklenmiştir. Shenzhen Tıbbi Disiplin İnşaatı (2016031638), Shenzhen Bilim ve Teknoloji Vakfı (JCJY20160229204849975, GJHZ201703141713575556), Shenzhen Sağlık ve Aile Planlama Komisyonu Vakfı (SZXJ2017021SZXJ2018059), Tıbbi Tıp Çin Guangdong Eyaleti Bilimsel Araştırma Vakfı (A2019218), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2018M633218).
Materials
| 0.22 μm Syringe-driven Filter Unit | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL Pasteur pipette | JingAn Biological, China | J00085 | |
| 5 mL syringe | Szboon, China | 20170829 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 5-0 surgical suture | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
| 60 mL syringe | Szboon, China | 20170623 | |
| 75% Ethanol | LIRCON, China | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilution (1:200) |
| anti-mouse Glucagon antibody | Abcam | ab10988 | Dilution (1:100) |
| anti-mouse insulin antibody | Cell Signaling Technology | 3014s | Dilution (1:100) |
| blunt-pointed perfusion needle | Oloey, China | 005 | 32G, yellow |
| BSA | Meilune, China | MB4219 | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | 8~10 weeks | |
| cell culture dish | BIOFIL, China | TCD000100 | General,Non-treated,87.8 mm diameter |
| centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
| cephalosporin | Lukang medical, China | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
| collagenase Type V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| D-hank's buffer | Coolaber, China | PM5140-10 | |
| dithizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| fluorescein diacetate (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| fluorescent microscope | Leica | DMIL | |
| gel-loading pipet tips | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Iodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
| light-tight culture dish | DVS, China | AN-5058548 | self-made, glass dish sprayed with black paint |
| Medical Adhesive Tape | Cofoe, China | K12001 | |
| non-invasive microtweezers | RWD Life Science | F11033-11 and F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| ophthalmic scissors | RWD Life Science | S12012-12 and S11001-08 | |
| P/S (penicillin / streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (streptozotocin) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Test Strip | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilution (1:200) |
| vascular clamp | RWD Life Science | R31006-04 |
Referências
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), 007823 (2012).
- Pathak, V., Pathak, N. M., O’Neill, C. L., Guduric-Fuchs, J., Medina, R. J. Therapies for Type 1 Diabetes: Current Scenario and Future Perspectives. Clinical Medicine Insights: Endocrinology and Diabetes. 12, 1179551419844521 (2019).
- Bottino, R., Knoll, M. F., Knoll, C. A., Bertera, S., Trucco, M. M. The Future of Islet Transplantation Is Now. Frontiers in Medicine (Lausanne). 5, 202 (2018).
- Stokes, R. A., et al. Transplantation sites for human and murine islets. Diabetologia. 60 (10), 1961-1971 (2017).
- van der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N., Cooper, D. K. The choice of anatomical site for islet transplantation. Cell Transplantation. 17 (9), 1005-1014 (2008).
- Addison, P., Fatakhova, K., Rodriguez Rilo, H. L. Considerations for an Alternative Site of Islet Cell Transplantation. Journal of Diabetes Science and Technology. , (2019).
- Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. Clinical islet transplantation: is the future finally now. Current Opinion in Organ Transplantation. 23 (4), 428-439 (2018).
- Bellin, M. D., et al. Similar islet function in islet allotransplant and autotransplant recipients, despite lower islet mass in autotransplants. Transplantation. 91 (3), 367-372 (2011).
- Bruni, A., Gala-Lopez, B., Pepper, A. R., Abualhassan, N. S., Shapiro, A. J. Islet cell transplantation for the treatment of type 1 diabetes: recent advances and future challenges. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 7, 211-223 (2014).
- Smood, B., Bottino, R., Hara, H., Cooper, D. K. C. Is the renal subcapsular space the preferred site for clinical porcine islet xenotransplantation? Review article. International Journal of Surgery and Medicine. 69, 100-107 (2019).
- Luan, N. M., Iwata, H. Long-term allogeneic islet graft survival in prevascularized subcutaneous sites without immunosuppressive treatment. American Journal of Transplantation. 14 (7), 1533-1542 (2014).
- Yasunami, Y., et al. A Novel Subcutaneous Site of Islet Transplantation Superior to the Liver. Transplantation. 102 (6), 945-952 (2018).
- Rajab, A. Islet transplantation: alternative sites. Current Diabetes Reports. 10 (5), 332-337 (2010).
- Ekser, B., Vagefi, P. A. Search for the best site in islet xenotransplantation. International Journal of Surgery and Medicine. 70, 106-107 (2019).
- Lu, Y., et al. A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse. Journal of Visualized Experiments. (143), e57160 (2019).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments. (88), e50374 (2014).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), e2096 (2011).
- Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57559 (2018).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
