Modelo de trasplante de tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal (ISWAT) de islotes murinos
Summary
En este protocolo, se describe un método de aislamiento de islotes murinos y trasplante en el tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal. Los islotes murinos sinémicos aislados se trasplantan en un receptor murino utilizando un hidrogel de membrana del sótano. Se controla el nivel de glucosa en sangre de los receptores y se realiza un análisis histológico de los injertos de islos.
Abstract
El trasplante de islotes pancreáticos es un tratamiento terapéutico bien establecido para la diabetes tipo 1. La cápsula renal es el sitio más utilizado para el trasplante de islotes en modelos de roedores. Sin embargo, la cápsula renal apretada limita el trasplante de islotes suficientes en animales grandes y humanos. Se encontró que el tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal (ISWAT), un nuevo espacio subcutáneo, era un sitio potencialmente valioso para el trasplante de islotes. Este sitio tiene mejor suministro de sangre que otros espacios subcutáneos. Además, el ISWAT acomoda una masa de islotes más grande que la cápsula renal, y el trasplante en ella es simple. Este manuscrito describe el procedimiento de aislamiento y trasplante de islotes de ratón en el sitio ISWAT de los receptores de ratones diabéticos singéricos. Usando este protocolo, los islotes pancreáticos murinos fueron aislados por la digestión de la colagenasa estándar y se utilizó un hidrogel de matriz de membrana del sótano para fijar los islotes purificados en el sitio ISWAT. Los niveles de glucosa en sangre de los ratones receptores se monitorizaron durante más de 100 días. Los injertos de islotes fueron recuperados en el día 100 después del trasplante para análisis histológicos. El protocolo para el trasplante de islotes en el sitio ISWAT descrito en este manuscrito es simple y eficaz.
Introduction
La incidencia y prevalencia mundial de la diabetes mellitus tipo 1 (T1DM) está aumentando rápidamente, según los datos estadísticos de la Federación Internacional de Diabetes (FID)1. El trasplante de islotes es uno de los enfoques más prometedores para el tratamiento de T1DM4. Dado que se informó del gran avance realizado en el trasplante clínico de islotes utilizando el protocolo Edmonton2, la supervivencia del injerto de islotes en funcionamiento en receptores de T1DM después de 5 años ahora alcanza aproximadamente el 50%3.
En el pasado, se exploraron varios sitios de trasplante, como el hígado, la cápsula renal, el bazo, la región intramuscular, el espacio subcutáneo, la médula ósea y la bolsa omental para el trasplante experimental de islotes5,6,7. Algunos de los sitios anteriores han sido probados en entornos clínicos8. Aunque el trasplante de islotes en el hígado sigue siendo el método más utilizado en la aplicación clínica en la actualidad9,hay varios problemas importantes para abordar cuando se utiliza este sitio. Por ejemplo, cómo reducir la pérdida temprana de los islotes trasplantados causada por la reacción inflamatoria mediada instantánea en sangre (IBMIR) y el suministro de mala oxigenación10,11 y cómo recuperar los injertos de islotes si es necesario, porque se localizan difusamente en el hígado. La cápsula renal puede ser un sitio ideal para los receptores de roedores. Sin embargo, la cápsula renal apretada limita el trasplante de suficientes islotes alogénicos en humanos, aunque puede ser un mejor ajuste para el xenotrasplante de islotes debido a las preparaciones de islotes porcinos altamente purificadas utilizadas clínicamente5,12. Por lo tanto, la búsqueda de un sitio más adecuado para el trasplante de islotes está en curso.
El espacio subcutáneo puede utilizarse como un sitio clínicamente aplicable para el trasplante de islotes debido a su accesibilidad. Sin embargo, la eficiencia del trasplante de islotes en el espacio subcutáneo es extremadamente baja, por lo que requiere un número relativamente grande de islotes para revertir la hiperglucemia13. Recientemente, un equipo de investigación japonés encontró el ISWAT, un sitio subcutáneo novedoso superior para el trasplante de islotes en un modelo murino en comparación con el hígado14. El ISWAT contiene la arteria epigástrica y la vena, por lo que el suministro de sangre rica puede asegurar la revascularización del injerto de islet. En este manuscrito, proponemos un método de implantación fácil utilizando un hidrogel de matriz de membrana de sótano para fijar islotes murinos sinémicos en el ISWAT. Este protocolo resulta eficaz para el trasplante de islotes.
Protocol
Representative Results
Discussion
El trasplante de islotes de páncreas es una terapia prometedora para tratar la T1DM. El efecto de esta terapia se ve afectado por muchos factores y elegir un sitio óptimo para la implantación de islotes es extremadamente importante. El sitio anatómico ideal para el trasplante de islotes debe tener las siguientes características: accesibilidad para trasplantes simples, biopsia sin procedimientos de recuperación de injertos; complicaciones reducidas; alta tasa de éxito del control de la glucosa en sangre; y la super…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional Clave de I+D de China (2017YFC1103704)Fondos Especiales para la Construcción de Hospitales de Alto Nivel en la Provincia de Guangdong (2019), Proyecto Sanming de Medicina en Shenzhen (SZSM201412020), Fondo para el Alto Nivel Construcción de disciplina médica de Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZJ2018059), Medical Fundación de Investigación Científica de la Provincia China de Guangdong (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).
Materials
| 0.22 μm Syringe-driven Filter Unit | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| 1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 5 mL Pasteur pipette | JingAn Biological, China | J00085 | |
| 5 mL syringe | Szboon, China | 20170829 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 5-0 surgical suture | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
| 60 mL syringe | Szboon, China | 20170623 | |
| 75% Ethanol | LIRCON, China | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilution (1:200) |
| anti-mouse Glucagon antibody | Abcam | ab10988 | Dilution (1:100) |
| anti-mouse insulin antibody | Cell Signaling Technology | 3014s | Dilution (1:100) |
| blunt-pointed perfusion needle | Oloey, China | 005 | 32G, yellow |
| BSA | Meilune, China | MB4219 | |
| C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | 8~10 weeks | |
| cell culture dish | BIOFIL, China | TCD000100 | General,Non-treated,87.8 mm diameter |
| centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
| cephalosporin | Lukang medical, China | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
| collagenase Type V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| D-hank's buffer | Coolaber, China | PM5140-10 | |
| dithizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| fluorescein diacetate (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
| fluorescent microscope | Leica | DMIL | |
| gel-loading pipet tips | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Iodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
| light-tight culture dish | DVS, China | AN-5058548 | self-made, glass dish sprayed with black paint |
| Medical Adhesive Tape | Cofoe, China | K12001 | |
| non-invasive microtweezers | RWD Life Science | F11033-11 and F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| ophthalmic scissors | RWD Life Science | S12012-12 and S11001-08 | |
| P/S (penicillin / streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (streptozotocin) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Test Strip | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilution (1:200) |
| vascular clamp | RWD Life Science | R31006-04 |
Referências
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