Stegvis doseringsprotokoll för ökat dataflöde i etikettfria Impedansbaserade GPCR-analyser
Summary
Detta protokoll visar realtidsregistrering av full dosresponsrelationer för agonist-inducerad GPCR-aktivering från ett enda cellskikt som odlas på en enda mikroelektrod med etikettfria impedansmätningar. Det nya doseringssystemet ökar avsevärt dataflödet utan förlust i tidslösning.
Abstract
Etikettfria impedansbaserade analyser används i allt högre grad för att icke-invasivt studera ligand-inducerad GPCR-aktivering i cellodlingsexperiment. Metoden ger cellövervakning i realtid med en enhetsberoende tidsupplösning ner till flera tiotals millisekunder och den är mycket automatiserad. Men när provsiffrorna blir höga (t.ex. dosresponsstudier för olika ligands) kan dock kostnaden för de engångselektrodmatriser som tillgänglig tidsupplösning för sekventiella well-by-well-inspelningar bli begränsande. Därför presenterar vi här ett seriellt agonistiskt tilläggsprotokoll som har potential att avsevärt öka produktionen av etikettfria GPCR-analyser. Med hjälp av det seriella agonistiska tilläggsprotokollet läggs en GPCR-agonist till sekventiellt i ökande koncentrationer till ett enda celllager samtidigt som provets impedans (agonistläge) kontinuerligt övervakar provets impedans (agonistläge). Med denna seriella metod är det nu möjligt att fastställa en full dos-responskurva för en GPCR-agonist från bara ett celllager. Det seriella agonisttilläggsprotokollet gäller för olika GPCR kopplingstyper, Gq Gi/0 eller Gs och det är kompatibelt med rekombinant och endogena uttrycksnivåer av receptorn som studeras. Receptorblockering av GPCR-antagonister är också bedömningsbar (antagonistläge).
Introduction
Denna rapport presenterar en detaljerad beskrivning av ett följetong tillägg protokoll som utvecklats för kvantifiering av ligand-inducerad G protein-kopplade receptor (GPCR) aktivering i adherentodlade celler genom etikett-fri impedans mätningar. G proteinkopplade receptorer (GPCRs) är involverade i en mängd fysiologiska funktioner och mänskliga sjukdomar1. På grund av detta och deras goda tillgänglighet på cellytan är GPCRs ett av de viktigaste läkemedelsmålen. Denna bedömning återspeglas i ett uppskattat antal ~ 700 godkända läkemedel som riktar sig till GPCRs, vilket motsvarar en ~ 35% andel på alla marknadsförda läkemedel2.
Utvecklingen av nya läkemedel omfattar två centrala processer: i) identifiering och funktionell karakterisering av biologiska målmolekyler, och (ii) upptäckten av nya blyämnen och deras utveckling till administrerade läkemedel. I båda processerna krävs effektiva metoder för att kvantitativt utvärdera interaktion mellan läkemedel och den efterföljande biologiska nedströmsreaktionen. Olika stadier av den prekliniska läkemedelsutvecklingsprocessen använder sig av olika analysmetoder, från biomolekylära interaktionsstudier mellan läkemedel och mål, över funktionella studier på celler i kultur, till experiment på struket organmaterial eller hela djur. Både fysiologisk betydelse och biologisk komplexitet ökar från den förra till de senare3. Även om det är det övergripande målet att minimera djurförsök, farmakologiska studier med hjälp av isolerade organ från försöksdjur eller till och med hela djur anses oundvikliga att omfattande karakterisera nya läkemedelskandidater. När det gäller analytisk avläsning ger organfarmakologistudier ett distala, integrativ “holistiskt” funktionellt svar av högsta fysiologiska relevans. En nackdel med sådana experiment är att de inte är förenliga med hög genomströmning screening av tekniska och etiska skäl och har till stor del ersatts av studier baserade på in vitro cell kultur4.
Metoder för att kvantifiera GPCR aktivering i cellkulturer inkluderar olika etikett-baserade kemiska analyser, som specifikt upptäcka andra budbärare, fosforylering tillstånd nedströms signalering proteiner, transkriptional aktivering via vissa transkriptionsfaktorer eller ligand-inducerad intracellulära receptortrafficking4,5. En nackdel med sådana etikettbaserade analyser är behovet av att märka cellerna med potentiellt skadliga färgämnen eller radioaktiva markörer. Detta kräver ofta att köra analysen som en slutpunkt-bestämning för en exponeringstid som måste anges a priori. Använda etikettbaserade endpoint analyser lider av denna mycket begränsade och partiska tidpunkten för experimentet och risken för att kemiska etiketter och sonder kan störa den vanliga cellfysiologin – potentiellt obemärkt av experimentören.
Under de senaste åren har etikettfria analyser för övervakning av GPCR-aktivering uppstått, som impedansbaserade tekniker eller optiska metoder som tillämpar resonansvågsgaller5,6. Märkning av cellerna krävs experimentellt inte med dessa metoder. Eftersom dessa fysiska avläsningar fungerar på låg amplitud signaler, sådana metoder anses icke-invasiva, de möjliggör kontinuerlig cellövervakning potentiellt i realtid och observationstiden begränsas endast av cellkulturen inte av avläsningen. I likhet med avläsningar från hela organ, etikett-fria metoder rapporterar vanligen om holistiska cellsvar, långt nedströms receptoraktivering när integration längs hela signalnätverket leder till tidsberoende men ganska ospecifika förändringar i cellmorfologi eller massomfördelning. Impedansbaserade analyser mäter den dielektriska signaturen av förändringar i cellform7,8,och mätningar med hjälp av resonant waveguide galler är känsliga för förändringar i brytningsindex vid cell-substrat gränssnitt som härrör från dynamisk massomfördelning (DMR)9. Den integrativ karaktär gör etikett-fria metoder extremt känsliga för receptormedierad händelser oavsett vilken typ (s) av G protein (Gq,Gi/0, Gs, G12/13) eller β-arrestin inblandade i signalkaskad6 och väl lämpad för endogena uttryck nivåer av receptorn.
I en standard etikett-fri impedans-baserad analys cellerna är adherently odlas i multi-well plattor med coplanar guld-film elektroder deponeras på botten av varje brunn10. Dessa elektrodarrayer är anslutna till en impedansanalysator och cellsvaren på en experimentell stimulans registreras från individuella brunnar genom tidslösta impedansavläsningar. I en typisk GPCR analys en ligand läggs i individuellt olika koncentrationer till varje individ väl. De ligand-inducerad förändringar i impedans tidkursen analyseras sedan med avseende på karakteristiska kurva funktioner såsom maximal signalförändring, område under kurvan, signalförändring inom ett givet tidsintervall eller lutning av kurvan vid en viss tidpunkt, för att kvantifiera ligand en potens och effekt11.
Kostnaden för elektrodmatriserna kan begränsa tillämpningen av denna teknik i hts-kampanjer (High Genomströmning). Dessutom ökar antalet enskilda mätningar och minskar därmed den tillgängliga tidsupplösningen för varje brunn gradvis – även för toppmoderna flerkanalsinspelningar. Under sådana förhållanden kan snabba och tillfälliga cellsvar undgå mätningen. Dessutom innebär den konventionella enbrunnen – en koncentrationsmetod en betydande tids- och kostnadsfaktor för perfunderas organ-on-chip eller body-on-chip-utveckling med avseende på deras lämplighet i ligand-GPCR interaktionsanalys.
Av denna anledning utvecklade vi en stegvis dosering protokoll som möjliggör registrering av full dos-respons kurvor av ligand-inducerad GPCR aktivering i odlade cell monolayers genom att kontinuerligt övervaka impedans av en enda brunn medan den agonistiska koncentrationen ökar stegvis. Det seriella agonisttilläggsprotokollet ökar signifikant dataflödet per brunn från en koncentration till 10 eller fler koncentrationer, vilket visas på det aktuella exemplet på mänskliga U-373 MG-celler, som endogenöst uttrycker histamin 1-receptorn (H1R). Metoden har således potential att avsevärt förbättra dataflödet i etikettfria dosresponsstudier, medan tidsupplösningen behålls vid det instrumentella högsta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för etikettfria impedansmätningar för att bestämma dosresponsförhållandet hos agonist-inducerad GPCR-aktivering i frånvaro eller närvaro av specifika antagonister för samma receptor. Beviset på begreppet för denna metod presenterades i en nyligen publiceradpublikation 12. Vår kännedom är det den första studien som beskriver inrättandet av en fullständig dosresponskurva av agonistisk-medierad GPCR-aktivering med hjälp av ett enda celllager in vit…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Barbara Goricnick och Nadja Hinterreiter för deras hjälp med cellodling och beredning av experimentella lösningar. Författarna erkänner tacksamt ekonomiskt stöd av Research Training Group 1910 “Medicinal chemistry of selective GPCR ligands” som finansieras av Den tyska forskningsstiftelsen (DFG) under bidragnummer 222125149. JAS är särskilt tacksam för ett stipendium som beviljats av det bayerska jämställdhetsprogrammet.
Materials
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | ||
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) | |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 – 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 – 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) |
Referências
- Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
- Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs. Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).
- Kaitin, K. I. Deconstructing the drug development process: The new face of innovation. Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).
- Kenakin, T. P. Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).
- Scott, C. W., Peters, M. F. Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening. Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophysical Journal. 91, 16 (2006).
- Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).
- Lieb, S., et al. Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor. Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).
- Stolwijk, J. A., et al. Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol. Integrative Biology. 11, 10 (2019).
