بروتوكول الدوس خطوة بخطوة لزيادة الإنتاجية في مقالات GPCR المستندة إلى المعاوقة الخالية من التسميات
Summary
يوضح هذا البروتوكول التسجيل في الوقت الحقيقي لعلاقات الجرعة والاستجابة الكاملة لتنشيط GPCR الناجم عن الجرعة من طبقة خلية واحدة تزرع على قطب صغير واحد باستخدام قياسات مقاومة خالية من التسمية. يزيد نظام الدوس الجديد بشكل كبير من الإنتاجية دون فقدان في دقة الوقت.
Abstract
يتم استخدام الاختبارات المستندة إلى المعاوقة الخالية من الملصقات بشكل متزايد لدراسة تنشيط GPCR الناجم عن ligand غير الغازية في تجارب زراعة الخلايا. يوفر هذا النهج في الوقت الحقيقي رصد الخلية مع دقة الوقت التي تعتمد على الجهاز وصولا الى عدة عشرات من ميلي ثانية وأنه مؤتمتة للغاية. ومع ذلك، عندما ترتفع أعداد العينات (على سبيل المثال، دراسات الاستجابة للجرعة لمختلف الليغاندات المختلفة)، قد تصبح تكلفة صفائف الأقطاب الكهربائية التي يمكن التخلص منها وكذلك دقة الوقت المتاحة للتسجيلات المتسلسلة من قبل البئر محدودة. ولذلك ، فإننا نقدم هنا بروتوكول إضافة ناهض المسلسل الذي لديه القدرة على زيادة كبيرة في الناتج من تخفيضات GPCR خالية من التسمية. باستخدام بروتوكول إضافة الناضر التسلسلي ، يتم إضافة جهاز GPCR agonist بالتتابع في زيادة التركيزات إلى طبقة خلية واحدة مع مراقبة مقاومة العينة باستمرار (وضع الناضر). مع هذا النهج التسلسلي، فمن الممكن الآن لإنشاء منحنى الجرعة استجابة كاملة لGPCR الناقد من طبقة خلية واحدة فقط. ينطبق بروتوكول الإضافة المؤنّد التسلسلي على أنواع اقتران GPCR المختلفة ، Gq Gi/0 أوG s وهو متوافق مع مستويات التعبير المؤتلفة والذاتية للمستقبلات قيد الدراسة. مستقبلات منع من قبل خصوم GPCR هو تقييم كذلك (وضع الخصم).
Introduction
يقدم هذا التقرير وصفاً مفصلاً لبروتوكول الإضافة التسلسلية الذي تم تطويره للقياس الكمي لتنشيط مستقبلات البروتين المقترنة بالبروتين (GPCR) التي يسببها ليغاند (GPCR) في الخلايا المزروعة بالارتباط بواسطة قياسات المعاوقة الخالية من التسمية. وتشارك مستقبلات البروتين G مقرونة (GPCRs) في العديد من الوظائف الفسيولوجية والأمراض البشرية1. وبسبب هذا وسهولة الوصول إليها على سطح الخلية ، GPCRs هي واحدة من أهم أهداف المخدرات. وينعكس هذا التقييم في عدد يقدر بنحو 700 دواء معتمد يستهدف الـ GPCRs، أي ما يعادل حصة تبلغ ~ 35٪ على جميع الأدوية المسوقة2.
ويشمل استحداث عقاقير جديدة عمليتين رئيسيتين هما: ‘1’ تحديد الجزيئات البيولوجية المستهدفة وتوصيفها الوظيفي، و’2′ اكتشاف مواد الرصاص الجديدة وتطويرها لتصبح أدوية قابلة للإدارة. وفي كلتا العمليتين، يلزم استخدام أساليب فعالة لتقييم التفاعلات بين المخدِّرات والأهداف والاستجابة البيولوجية اللاحقة. مراحل مختلفة من عملية تطوير المخدرات قبل السريرية الاستفادة من أساليب مختلفة للتحليل تتراوح بين دراسات التفاعل الجزيئي الحيوي بين المخدرات والهدف، على الدراسات الوظيفية على الخلايا في الثقافة، إلى التجارب على مواد الأعضاء المستأصلة أو الحيوانات بأكملها. على حد سواء ، والأهمية الفسيولوجية والتعقيد البيولوجي زيادة من السابق إلى3الأخيرة. على الرغم من أن الهدف العام هو تقليل التجارب الحيوانية ، إلا أن الدراسات الدوائية باستخدام الأعضاء المعزولة من الحيوانات المختبرية أو حتى الحيوانات الكاملة تعتبر حتمية لتوصيف شامل للمرشحين الجدد للأدوية. من حيث القراءة التحليلية ، توفر دراسات علم أدوية الأعضاء استجابة وظيفية “شاملة” متكاملة ذات أهمية فسيولوجية أعلى. ومن عيوب هذه التجارب أنها لا تتوافق مع فحص الإنتاجية العالية لأسباب تقنية وأخلاقية، وقد تم استبدالها إلى حد كبير بدراسات تستند إلى ثقافة الخلية المختبرية4.
طرق لقياس تنشيط GPCR في ثقافات الخلايا تشمل مختلف الاختبارات الكيميائية القائمة على التسمية، والتي تكشف على وجه التحديد الرسل الثانية، وحالة الفوسفور من البروتينات الإشارات المصب، وتفعيل النسخ عبر عوامل النسخ معينة أو ligand الناجمة عن الاتجار مستقبلات داخل الخلايا4،5. ومن عيوب هذه المقالات المستندة إلى التسميات ضرورة تسمية الخلايا بأصباغ أو علامات مشعة قد تكون ضارة. وهذا غالباً ما يتطلب تشغيل المنقّأ كـ تحديد نقطة النهاية لوقت تعرض يجب أن يتم تحديده مسبقاً. إن استخدام اختبارات نقطة النهاية المستندة إلى التسميات يعاني من هذا التوقيت المحدود والمتحيز للغاية للتجربة وخطر أن التسميات الكيميائية والمسابير قد تتداخل مع فسيولوجيا الخلايا العادية – التي قد لا يلاحظها المجرب.
في السنوات الأخيرة ، ظهرت مقالات خالية من التسمية لرصد تنشيط GPCR ، مثل التقنيات القائمة على المعاوقة أو الأساليب البصرية التي تطبق صريف اتصال الرنانة5،6. ولا يشترط وضع علامات على الخلايا من الناحية التجريبية في هذه النُهج. كما هذه القراءة المادية تعمل على إشارات السعة المنخفضة، وتعتبر هذه الأساليب غير الغازية، فإنها تسمح للرصد المستمر الخلية يحتمل في الوقت الحقيقي ووقت المراقبة محدودة فقط من قبل ثقافة الخلية وليس من قبل القراءة. على غرار عمليات القراءة من أجهزة كاملة ، وعادة ما يقدم نهج خالية من التسمية على استجابات الخلايا الشاملة ، بعيدا المصب من تنشيط مستقبلات عندما التكامل على طول شبكة الإشارات بأكملها يؤدي إلى تغييرات تعتمد على الوقت ولكن بدلا غير محددة في مورفولوجيا الخلية أو إعادة توزيع الشامل. في حين أن الاختبارات المستندة إلى المعاوقة تقيس التوقيع العازل للتغيرات في شكل الخلية7،8، فإن القياسات التي تستخدم صريفات الموجات الرنانة حساسة للتغيرات في مؤشر الانكسار في واجهة الركيزة الخلوية الناشئة عن إعادة توزيع الكتلة الديناميكية (DMR)9. الطابع التكاملي يجعل أساليب خالية من التسمية حساسة للغاية للأحداث بوساطة مستقبلات بغض النظر عن نوع (ق) من البروتين G (Gس،Gi/0،Gs،G12/13)أو α-arrestin المشاركة في سلسلة الإشارات6 ومناسبة تماما لمستويات التعبير الذاتية من المستقبلات.
في معيار المعاوقة خالية من المعاوقة على أساس المعاوقة نمت الخلايا في لوحات متعددة الآبار مع أقطاب coplanar الذهب فيلم المودعة في الجزء السفلي من كل بئر10. وترتبط هذه الصفائف القطب إلى محلل المعاوقة ويتم تسجيل استجابات الخلية إلى التحفيز التجريبي من الآبار الفردية عن طريق قراءات المعاوقة حل الوقت. في مقاضد GPCR نموذجي يتم إضافة ligand في تركيزات مختلفة بشكل فردي لكل فرد بشكل جيد. ثم يتم تحليل التغييرات الناجمة عن ligand في مسار وقت المعاوقة فيما يتعلق بميزات المنحنى المميزة مثل الحد الأقصى لتغيير الإشارة ، والمساحة تحت المنحنى ، وتغيير الإشارة في غضون فترة زمنية معينة أو ميل المنحنى في نقطة زمنية محددة ، من أجل تحديد فعالية وفعالية ligand11.
قد تحد تكلفة صفائف الأقطاب الكهربائية من تطبيق هذه التقنية في حملات الفحص عالي الإنتاجية (HTS). وعلاوة على ذلك ، مع تزايد أعداد العينات التي يتعين اتباعها بالتوازي ، يزيد عدد القياسات الفردية وبالتالي يقلل من دقة الوقت المتاحة لكل بئر تدريجيا – حتى بالنسبة للتسجيلات المتعددة القنوات. في ظل هذه الظروف قد الاستجابات الخلية سريعة وعابرة الهروب من القياس. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أحد الأساليب التقليدية – نهج تركيز واحد يفرض عامل وقت وتكلفة كبير على التطورات المُطَلَّبة على الأجزاء أو الأجزاء على الشريحة فيما يتعلق بملاءمتها في تحليل تفاعل ligand-GPCR.
لهذا السبب، وضعنا بروتوكول الجرعات خطوة خطوة خطوة التي تمكن من تسجيل منحنيات الاستجابة الجرعة الكاملة من تنشيط GPCR الناجم عن ligand في أحادية الخلية المستزرعة عن طريق الرصد المستمر لمعاوقة بئر واحد في حين يتم زيادة تركيز ناهدي خطوة بخطوة. يزيد بروتوكول الإضافة المغطورية التسلسلي بشكل كبير من الإنتاجية لكل بئر من تركيز واحد إلى 10 تركيزات أو أكثر ، كما هو موضح في المثال الحالي لخلايا U-373 MG البشرية ، والتي تعبر بشكل داخلي عن مستقبلات الهيستامين 1 (H1R). وبالتالي، فإن الأسلوب لديه القدرة على تحسين الإنتاجية بشكل كبير في دراسات الاستجابة للجرعة الخالية من التسمية، في حين يتم الاحتفاظ بالدقة الزمنية في الحد الأقصى الفعال.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة لقياسات المعاوقة الخالية من الملصقات لتحديد علاقة الجرعة والاستجابة لتنشيط GPCR الناجم عن الالوطنية في غياب أو وجود مضادات محددة لنفس المستقبلات. وقد تم تقديم إثبات مفهوم هذه الطريقة في منشور صدر مؤخرا12. على حد علمنا هو أول دراسة تصف إنشاء منحنى الجرعة…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر باربرا غوريك وناديا هينترتيتر على مساعدتهما في زراعة الخلايا وإعداد الحلول التجريبية. وينوه بامتنان المؤلفون بالدعم المالي من قبل مجموعة التدريب البحثي 1910 “الكيمياء الطبية للجي بيندس الانتقائية GPCR” الممولة من مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) تحت رقم المنحة 222125149. وتعرب وزارة الشؤون الاجتماعية عن امتنانها بصفة خاصة للمنحة الدراسية التي منحها برنامج بافاريا للمساواة بين الجنسين.
Materials
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | ||
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) | |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 – 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 – 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) |
Referências
- Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
- Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs. Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).
- Kaitin, K. I. Deconstructing the drug development process: The new face of innovation. Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).
- Kenakin, T. P. Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).
- Scott, C. W., Peters, M. F. Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening. Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophysical Journal. 91, 16 (2006).
- Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).
- Lieb, S., et al. Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor. Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).
- Stolwijk, J. A., et al. Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol. Integrative Biology. 11, 10 (2019).
