Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impeddance-Based GPCR Assays
Summary
Dieses Protokoll zeigt die Echtzeitaufzeichnung von volldosierten Reaktionsbeziehungen für die agonistisch-induzierte GPCR-Aktivierung von einer einzelnen Zellschicht, die auf einer einzelnen Mikroelektrode mit etikettenfreien Impedanzmessungen angebaut wird. Das neue Dosierschema erhöht den Durchsatz deutlich, ohne dass die Zeitauflösung verloren geht.
Abstract
Etikettenfreie Impedanz-basierte Assays werden zunehmend zur nicht-invasiven Untersuchung der ligaandinduzierten GPCR-Aktivierung in Zellkulturexperimenten eingesetzt. Der Ansatz bietet Echtzeit-Zellüberwachung mit einer geräteabhängigen Zeitauflösung bis zu mehreren Dutzend Millisekunden und ist hochautomatisiert. Wenn jedoch die Probenzahlen hoch werden (z. B. Dosis-Wirkungs-Studien für verschiedene Liganden), können die Kosten für die Einweg-Elektroden-Arrays sowie die verfügbare Zeitauflösung für sequenzielle Well-by-Well-Aufnahmen begrenzt werden. Daher stellen wir hier ein serielles Agonisten-Zusatzprotokoll vor, das das Potenzial hat, die Leistung von etikettenfreien GPCR-Assays deutlich zu erhöhen. Mit Hilfe des seriellen Agonisten-Additionsprotokolls wird ein GPCR-Agonist sequenziell bei der Erhöhung der Konzentrationen zu einer einzelnen Zellschicht hinzugefügt, während die Impedanz der Probe kontinuierlich überwacht wird (Agonistenmodus). Mit diesem seriellen Ansatz ist es nun möglich, eine vollständige Dosis-Wirkungs-Kurve für einen GPCR-Agonisten aus nur einer einzigen Zellschicht zu etablieren. Das serielle Agonisten-Zusatzprotokoll ist auf verschiedene GPCR-Kopplungstypen, Gq Gi/0 oder Gs, anwendbar und mit rekombinanten und endogene Expressionsniveaus des untersuchten Rezeptors kompatibel. Die Rezeptorblockierung durch GPCR-Antagonisten ist ebenfalls bewertbar (Antagonistenmodus).
Introduction
Dieser Bericht enthält eine detaillierte Beschreibung eines seriellen Additionsprotokolls, das zur Quantifizierung der Liganden-induzierten G-Protein-gekoppelten Rezeptoraktivierung (GPCR) in anhaftend angebauten Zellen durch etikettenfreie Impedanzmessungen entwickelt wurde. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind an einer Vielzahl physiologischer Funktionen und menschlicher Krankheiten beteiligt1. Aufgrund dieser und ihrer guten Zugänglichkeit an der Zelloberfläche sind GPCRs eines der wichtigsten Wirkstoffziele. Diese Bewertung spiegelt sich in einer geschätzten Zahl von 700 zugelassenen Arzneimitteln wider, die auf DIE GPCR abzielen, was einem Anteil von 35 % an allen vermarkteten Arzneimitteln entspricht2.
Die Entwicklung neuer Medikamente umfasst zwei zentrale Prozesse: (i) die Identifizierung und funktionelle Charakterisierung biologischer Zielmoleküle und (ii) die Entdeckung neuer Bleisubstanzen und deren Entwicklung zu administrierbaren Arzneimitteln. In beiden Prozessen sind effiziente Methoden erforderlich, um Wirkstoff-Ziel-Wechselwirkungen und die anschließende biologische nachgeschaltete Reaktion quantitativ zu bewerten. Verschiedene Stadien des präklinischen Arzneimittelentwicklungsprozesses nutzen verschiedene Analysemethoden, die von biomolekularen Interaktionsstudien zwischen Medikament und Ziel, über funktionelle Studien an Zellen in der Kultur bis hin zu Experimenten an ausgeschnittenem Organmaterial oder ganzen Tieren reichen. Sowohl die physiologische Bedeutung als auch die biologische Komplexität nehmen von ersterer bis zu letzterer3zu. Obwohl es das übergeordnete Ziel ist, Tierversuche zu minimieren, werden pharmakologische Studien mit isolierten Organen von Labortieren oder sogar ganzen Tieren als unvermeidlich angesehen, um neue Wirkstoffkandidaten umfassend zu charakterisieren. In analytischer Auslesung bieten Organpharmakologiestudien eine distale, integrative “ganzheitliche” funktionelle Reaktion von höchster physiologischer Relevanz. Ein Nachteil solcher Experimente ist, dass sie aus technischen und ethischen Gründen nicht mit einem Hochdurchsatz-Screening kompatibel sind und weitgehend durch Studien auf der Grundlage der In-vitro-Zellkultur4 ersetzt wurden.
Methoden zur Quantifizierung der GPCR-Aktivierung in Zellkulturen umfassen verschiedene etikettenbasierte chemische Assays, die speziell zweite Botenstoffe, Phosphorylierungszustand von nachgeschalteten Signalproteinen, Transkriptionsaktivierung über bestimmte Transkriptionsfaktoren oder Liganden-induzierten intrazellulären Rezeptorenhandel4,5. Ein Nachteil solcher etikettenbasierter Assays ist die Notwendigkeit, die Zellen mit potenziell schädlichen Farbstoffen oder radioaktiven Markern zu kennzeichnen. Dies erfordert häufig das Ausführen des Assays als Endpunktbestimmung für eine Expositionszeit, die a prioriangegeben werden muss. Die Verwendung von etikettenbasierten Endpunkt-Assays leidet unter diesem sehr begrenzten und voreingenommenen Timing des Experiments und dem Risiko, dass chemische Etiketten und Sonden die reguläre Zellphysiologie stören – möglicherweise unbemerkt vom Experimentator.
In den letzten Jahren sind etikettenfreie Assays zur Überwachung der GPCR-Aktivierung entstanden, wie Impedanz-basierte Techniken oder optische Methoden mit resonanten Wellenleitergittern5,6. Die Kennzeichnung der Zellen ist bei diesen Ansätzen experimentell nicht erforderlich. Da diese physikalischen Auslesungen mit Signalen mit geringer Amplitude betrieben werden, gelten solche Methoden als nicht-invasiv, sie ermöglichen eine kontinuierliche Zellüberwachung potenziell in Echtzeit und die Beobachtungszeit wird nur durch die Zellkultur und nicht durch das Auslesen begrenzt. Ähnlich wie aus ganzen Organen berichten labelfreie Ansätze häufig über ganzheitliche Zellreaktionen, weit nach der Rezeptoraktivierung, wenn die Integration entlang des gesamten Signalnetzes zu zeitabhängigen, aber eher unspezifischen Veränderungen in der Zellmorphologie oder Massenumverteilung führt. Während impedanzbasierte Assays die dielektrische Signatur von Veränderungen in der Zellform7,8messen, sind Messungen mit resonanzförmigen Wellenleitergittern empfindlich gegenüber Veränderungen des Brechungsindexes an der Zellsubstratschnittstelle, die sich aus der dynamischen Massenumverteilung (DMR)9ergeben. Der integrative Charakter macht etikettenfreie Methoden extrem empfindlich gegenüber Rezeptor-vermittelten Ereignissen, unabhängig von der Art(n) des G-Proteins (Gq, Gi/0, Gs, G12/13) oder ‘-arrestin, die an der Signalkaskade6 beteiligt sind und sich gut für endogene Expressionsniveaus des Rezeptors eignen.
In einem standardlabelfreien Impedanz-basierten Assay werden die Zellen in Multi-Well-Platten mit koplanaren Goldfilmelektroden, die auf der Unterseite jedes Brunnens abgelagertsind, 10anwachsen. Diese Elektroden-Arrays sind mit einem Impedanzanalysator verbunden und die Zellreaktionen auf einen experimentellen Reiz werden aus einzelnen Brunnen durch zeitaufgelöste Impedanzmessungen aufgezeichnet. In einem typischen GPCR-Test wird jedem einzelnen Brunnen ein Ligand in individuell unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt. Die Liganden-induzierten Veränderungen im Impedanz-Zeitverlauf werden dann in Bezug auf Merkmalskurvenmerkmale wie maximale Signaländerung, Fläche unter der Kurve, Signaländerung innerhalb eines bestimmten Zeitintervalls oder Steigung der Kurve zu einem bestimmten Zeitpunkt analysiert, um die Wirksamkeit und Wirksamkeit des Liganden zu quantifizieren11.
Die Kosten für die Elektroden-Arrays können die Anwendung dieser Technik in HTS-Kampagnen (High Throughput Screening) einschränken. Darüber hinaus steigt die Anzahl der Einzelmessungen mit zunehmender Anzahl parallel zu befolgender Proben und reduziert damit die verfügbare Zeitauflösung für jeden Brunnen schrittweise – auch bei modernsten Mehrkanalaufnahmen. Unter solchen Bedingungen können schnelle und vorübergehende Zellreaktionen der Messung entgehen. Darüber hinaus setzt der konventionelle Brunnen – ein Konzentrationsansatz einen signifikanten Zeit- und Kostenfaktor für durchfundierte Organ-on-Chip- oder Body-on-Chip-Entwicklungen in Bezug auf ihre Eignung in der Liganden-GPCR-Interaktionsanalyse.
Aus diesem Grund haben wir ein stufenweises Dosierungsprotokoll entwickelt, das die Aufzeichnung von Volldosis-Wirkungskurven der Liganden-induzierten GPCR-Aktivierung in kultivierten Zellmonolayern ermöglicht, indem die Impedanz eines einzelnen Brunnens kontinuierlich überwacht wird, während die Agonistenkonzentration schrittweise erhöht wird. Das serielle Agonistenadditionsprotokoll erhöht den Durchsatz pro Brunnen signifikant von einer Konzentration auf 10 oder mehr Konzentrationen, wie am aktuellen Beispiel menschlicher U-373-MG-Zellen gezeigt wird, die den Histamin-1-Rezeptor (H1R) endogen ausdrücken. Somit hat die Methode das Potenzial, den Durchsatz in etikettenfreien Dosis-Wirkungs-Studien deutlich zu verbessern, während die Zeitauflösung am instrumentellen Maximum beibehalten wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren für etikettenfreie Impedanzmessungen, um die Dosis-Wirkungs-Beziehung der agonistisch-induzierten GPCR-Aktivierung in Abwesenheit oder das Vorhandensein spezifischer Antagonisten für denselben Rezeptor zu bestimmen. Der Konzeptbeweis dieser Methode wurde kürzlich in einer Veröffentlichungvorgestellt 12. Unserer Kenntnis nach ist es die erste Studie, die die Etablierung einer vollständigen Dosis-Wirkungs-Kurve der agonistisch vermittelten GPCR-Aktivier…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Barbara Goricnick und Nadja Hinterreiter für ihre Hilfe bei der Zellkultivierung und der Vorbereitung experimenteller Lösungen. Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung durch das von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) geförderte Graduiertenkolleg 1910 “Medizinische Chemie selektiver GPCR-Liganden” unter der Fördernummer 222125149. Besonders dankbar ist JAS für ein Stipendium des Bayerischen Gleichstellungsprogramms.
Materials
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | ||
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) | |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 – 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 – 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) |
Referências
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