Protocolo de dosificación escalonada para aumentar el rendimiento en ensayos GPCR basados en impedancia sin etiquetas
Summary
Este protocolo demuestra el registro en tiempo real de las relaciones de dosis-respuesta completa para la activación gpCR inducida por agonistas a partir de una sola capa de células cultivada en un solo microelectrodo mediante mediciones de impedancia sin etiquetas. El nuevo esquema de dosificación aumenta significativamente el rendimiento sin pérdida en la resolución de tiempo.
Abstract
Los ensayos basados en impedancia sin etiquetas se utilizan cada vez más para estudiar de forma no invasiva la activación de GPCR inducida por ligandos en experimentos de cultivo celular. El enfoque proporciona supervisión de celdas en tiempo real con una resolución de tiempo dependiente del dispositivo hasta varias decenas de milisegundos y está altamente automatizado. Sin embargo, cuando los números de muestra son altos (por ejemplo, estudios de dosis-respuesta para varios ligandos diferentes), el costo de las matrices de electrodos desechables, así como la resolución de tiempo disponible para grabaciones secuenciales bien por pozo pueden llegar a ser limitador. Por lo tanto, aquí presentamos un protocolo de adición agonista en serie que tiene el potencial de aumentar significativamente la salida de ensayos GPCR sin etiquetas. Usando el protocolo de adición agonista en serie, un agonista GPCR se agrega secuencialmente en el aumento de las concentraciones a una sola capa de celda mientras se supervisa continuamente la impedancia de la muestra (modo agonista). Con este enfoque en serie, ahora es posible establecer una curva de dosis-respuesta completa para un agonista GPCR a partir de una sola capa de células. El protocolo de adición agonista en serie es aplicable a diferentes tipos de acoplamiento GPCR, Gq Gi/0 o Gs y es compatible con los niveles de expresión recombinantes y endógenos del receptor en estudio. El bloqueo de receptores por los antagonistas de GPCR también es evaluable (modo antagonista).
Introduction
Este informe presenta una descripción detallada de un protocolo de adición en serie desarrollado para la cuantificación de la activación del receptor acoplado a proteínaS G inducida por ligandos (GPCR) en células cultivadas adherentemente mediante mediciones de impedancia sin etiquetas. Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) participan en una multitud de funciones fisiológicas y enfermedades humanas1. Debido a esto y su buena accesibilidad en la superficie celular, los PCPR son uno de los objetivos de drogas más importantes. Esta evaluación se refleja en un número estimado de 700 medicamentos aprobados dirigidos a los GPCR, equivalente a una cuota del 35 % en todos los medicamentos comercializados2.
El desarrollo de nuevos fármacos comprende dos procesos centrales: i) la identificación y caracterización funcional de las moléculas diana biológicas, y ii) el descubrimiento de nuevas sustancias de plomo y su desarrollo en fármacos administrables. En ambos procesos, se requieren métodos eficientes para evaluar cuantitativamente las interacciones farmacológicas y la posterior respuesta biológica posterior. Diferentes etapas del proceso de desarrollo de fármacos preclínicos utilizan diferentes métodos de análisis que van desde estudios de interacción biomolecular entre fármaco y objetivo, sobre estudios funcionales sobre células en cultivo, hasta experimentos con material orgánico extirpado o animales enteros. Tanto el significado fisiológico como la complejidad biológica aumentan de los3primeros a los segundos. Aunque el objetivo general es minimizar los experimentos en animales, los estudios farmacológicos que utilizan órganos aislados de animales de laboratorio o incluso animales enteros se consideran inevitables para caracterizar exhaustivamente a los nuevos candidatos a fármacos. En términos de lectura analítica, los estudios farmacológicos de órganos proporcionan una respuesta funcional distal e integradora “holística” de mayor relevancia fisiológica. Un inconveniente de estos experimentos es que no son compatibles con el cribado de alto rendimiento por razones técnicas y éticas y han sido sustituidos en gran medida por estudios basados en el cultivo celular in vitro4.
Los métodos para cuantificar la activación de GPCR en cultivos celulares incluyen diferentes ensayos químicos basados en etiquetas, que detectan específicamente a los segundos mensajeros, el estado de fosforilación de las proteínas de señalización aguas abajo, la activación transcripcional a través de ciertos factores de transcripción o el tráfico de receptores intracelulares inducido por ligando4,5. Un inconveniente de estos ensayos basados en etiquetas es la necesidad de etiquetar las células con colorantes potencialmente dañinos o marcadores radiactivos. Esto a menudo requiere ejecutar el ensayo como una determinación de punto final para un tiempo de exposición que debe especificarse a priori. El uso de ensayos de punto final basados en etiquetas sufre de este momento muy limitado y sesgado del experimento y el riesgo de que las etiquetas químicas y las sondas puedan interferir con la fisiología celular regular, potencialmente desapercibida para el experimentador.
En los últimos años, han surgido ensayos sin etiquetas para el seguimiento de la activación de GPCR, como técnicas basadas en impedancia o métodos ópticos que aplican rejillas de guía de onda resonantes5,6. El etiquetado de las células no es necesario experimentalmente con estos enfoques. Como estas lecturas físicas operan en señales de baja amplitud, estos métodos se consideran no invasivos, permiten la supervisión continua de células potencialmente en tiempo real y el tiempo de observación sólo está limitado por el cultivo celular no por la lectura. Al igual que las lecturas de órganos enteros, los enfoques sin etiquetas suelen informar sobre las respuestas celulares holísticas, muy por debajo de la activación del receptor cuando la integración a lo largo de toda la red de señalización conduce a cambios dependientes del tiempo, sino más bien poco específicos en la morfología celular o la redistribución masiva. Mientras que los ensayos basados en impedancia miden la firma dieléctrica de los cambios en la forma de la célula7,8, las mediciones que utilizan rejillas de guía de onda resonantes son sensibles a los cambios en el índice de refracción en la interfaz de sustrato celular que se derivan de la redistribución dinámica de masa (DMR)9. El carácter integrador hace que los métodos libres de etiquetas sean extremadamente sensibles a los eventos mediados por receptores independientemente del tipo(s) de proteína G (Gq, Gi/0, Gs, G12/13)o -arrestina implicada en la cascada de señalización6 y adecuada para los niveles de expresión endógena del receptor.
En un ensayo estándar basado en impedancia sin etiquetas, las células se cultivan adherentemente en placas de varios pocillos con electrodos coplanares de película de oro depositados en la parte inferior de cada pozo10. Estas matrices de electrodos están conectadas a un analizador de impedancia y las respuestas celulares a un estímulo experimental se registran a partir de pozos individuales mediante lecturas de impedancia resueltas en el tiempo. En un ensayo típico de GPCR se añade un ligando en concentraciones individualmente diferentes a cada individuo bien. Los cambios inducidos por ligando en el curso de tiempo de impedancia se analizan con respecto a las características de la curva, como el cambio máximo de señal, el área bajo la curva, el cambio de señal dentro de un intervalo de tiempo determinado o la pendiente de la curva en un punto de tiempo especificado, con el fin de cuantificar la potencia y eficacia del ligando11.
El costo de las matrices de electrodos puede limitar la aplicación de esta técnica en campañas de detección de alto rendimiento (HTS). Además, con un número cada vez mayor de muestras a seguir en paralelo, el número de mediciones individuales aumenta y, por lo tanto, reduce la resolución de tiempo disponible para cada pocal gradualmente, incluso para las grabaciones multicanal de última generación. En tales condiciones, las respuestas celulares rápidas y transitorias pueden escapar de la medición. Además, el pozo convencional – un enfoque de concentración impone un factor de tiempo y costo significativo a los desarrollos de órgano en chip o cuerpo en chip perfundidos con respecto a su idoneidad en el análisis de interacción ligando-GPCR.
Por esta razón, desarrollamos un protocolo de dosificación escalonada que permite el registro de curvas de dosis-respuesta completa de activación GPCR inducida por ligando en monocapas celulares cultivadas mediante el monitoreo continuo de la impedancia de un solo pozo mientras que la concentración agonista se incrementa escalonadamente. El protocolo de adición agonista en serie aumenta significativamente el rendimiento por pozo de una concentración a 10 o más concentraciones, como se muestra en el ejemplo actual de células humanas U-373 MG, que endógenamente expresan el receptor de histamina 1 (H1R). Por lo tanto, el método tiene el potencial de mejorar significativamente el rendimiento en estudios de dosis-respuesta sin etiquetas, mientras que la resolución de tiempo se mantiene al máximo instrumental.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un método para mediciones de impedancia sin etiquetas para determinar la relación dosis-respuesta de activación GPCR inducida por agonistas en ausencia o presencia de antagonistas específicos para el mismo receptor. La prueba de concepto de este método se presentó en una publicación reciente12. Hasta nuestro conocimiento, es el primer estudio que describe el establecimiento de una curva de dosis-respuesta completa de activación GPCR mediada por agonistas utilizando …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Barbara Goricnick y Nadja Hinterreiter por su ayuda con el cultivo celular y la preparación de soluciones experimentales. Los autores agradecen el apoyo financiero del Research Training Group 1910 “Medicina química de ligandos GPCR selectivos” financiado por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) bajo el número de subvención 222125149. JAS está particularmente agradecido por una beca otorgada por el Programa Bávaro de Igualdad de Género.
Materials
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | ||
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) | |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 – 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 – 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) |
Referências
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