该协议演示了使用无标签阻抗测量从单个微电极上生长的单个细胞层的激动剂诱导GPCR活化的全剂量-反应关系的实时记录。新的配量方案显著提高了吞吐量,而不会损失时间分辨率。
在细胞培养实验中,基于标签的阻抗测定越来越多地用于非侵入性研究配体诱导的GPCR活化。该方法提供实时单元监控,与设备相关的时间分辨率降低至几十毫秒,并且高度自动化。然而,当样本数量变高(例如,不同配体的剂量反应研究)时,一次性电极阵列的成本以及连续井记录的可用时间分辨率可能会受到限制。因此,我们在这里提出了一个串行的激动剂添加协议,它有可能显著增加无标签GPCR检测的输出。使用串行激动剂添加协议,GPCR激动剂按顺序添加到单个细胞层,同时持续监测样品的阻抗(激动器模式)。通过这种串行方法,现在可以从单个细胞层为GPCR激动剂建立一个完整的剂量反应曲线。序列激动剂添加方案适用于不同的GPCR耦合类型,Gq Gi/0或Gs,与所研究受体的重组和内源表达水平兼容。GPCR 拮抗剂的受体阻塞也是可评估的(拮抗模式)。
本报告详细介绍了通过无标签阻抗测量,为在粘附生长细胞中结合诱导的G蛋白耦合受体(GPCR)激活的定量而开发的串行添加方案。G蛋白耦合受体(GPCRs)涉及多种生理功能和人类疾病1。由于这一点,并且在细胞表面具有良好的可访问性,GPCRs是最重要的药物靶点之一。这一评估反映在估计的700个针对全环苯酚的核准药物数量上,相当于所有上市药物2的35%的份额。
新药的开发包括两个中心过程:(一) 生物靶分子的鉴定和功能表征,和(二)发现新的铅物质及其发展成可管理药物。在这两个过程中,都需要有效的方法来定量评估药物-目标相互作用和随后的生物下游反应。临床前药物开发过程的不同阶段使用不同的分析方法,从药物和目标之间的生物分子相互作用研究,对培养细胞的功能研究,到切除器官材料或整个动物的实验。生理意义和生物复杂性从前者增加到后3。虽然尽量减少动物实验是总体目标,但使用实验室动物甚至整个动物的分离器官进行药理学研究对于全面描述新药候选者是不可避免的。在分析读出方面,器官药理学研究提供了一个与生理相关性最高的远端、综合的”整体”功能反应。这种实验的一个缺点是,由于技术原因和道德原因,它们与高通量筛选不兼容,并且在很大程度上被基于体外细胞培养4的研究所取代。
在细胞培养物中量化GPCR活化的方法包括不同的基于标签的化学测定,它专门检测第二信使、下游信号蛋白的磷酸化状态、通过某些转录因子转录激活或配体诱导的细胞内受体贩运4、5。这种基于标签的检测的缺点是有必要给细胞贴上可能有害的染料或放射性标记标签。这通常需要在必须先验指定的曝光时间中运行测定作为端点确定。使用基于标签的端点检测会受到实验时间非常有限和偏颇的影响,以及化学标签和探针可能干扰正常细胞生理学的风险,而实验者可能没有注意到。
近年来,用于监测GPCR活化的无标签检测已经出现,如基于阻抗的技术或应用谐振波导光栅5、6的光学方法。用这些方法在实验上不需要给细胞贴上标签。由于这些物理读出在低振幅信号上运行,这些方法被认为是非侵入性的,它们允许实时连续的细胞监测,观察时间仅受细胞培养的限制,而不是由读出。与来自整个器官的读出类似,无标签方法通常报告整体细胞反应,当沿整个信令网络集成导致细胞形态或大规模再分配的时间依赖性但非特定变化时,受体激活的下游。基于阻抗的测定测量细胞形状7、8变化的介电特征,使用谐振波导光栅的测量对动态质量再分配(DMR)9引起的细胞基体界面折射率的变化很敏感。综合特性使得无标签方法对受体介导事件极其敏感,而不管G蛋白(Gq、Gi/0、G12/13)或信号级联6中涉及的β-逮捕素,非常适合受体的内源表达水平。
在标准无标签阻抗测定中,细胞附着生长在多孔板中,共平面金膜电极沉积在每口井10的底部。这些电极阵列连接到阻抗分析仪,并且通过时间解析阻抗读数从单个孔中记录对实验刺激的单元响应。在典型的GPCR测定中,配体以不同的浓度分别添加到每个井中。然后,根据特征曲线特征(如最大信号变化、曲线下面积、给定时间间隔内的信号变化或指定时间点的曲线斜率)分析阻抗时间过程中的配体引起的变化,以量化配体的效力和功效11。
电极阵列的成本可能会限制该技术在高通量筛选(HTS) 运动中的应用。此外,随着要并行跟踪的样本数量不断增加,单个测量的数量也会增加,从而逐渐降低每个油井的可用时间分辨率,甚至对于最先进的多通道记录也是如此。在这种情况下,快速和瞬态细胞响应可能逃避测量。此外,传统的一井-一种浓度方法对片上或片上机的注入器官开发在配体-GPCR相互作用分析中的适用性而言,具有显著的时间和成本因素。
为此,我们开发了一种分步剂量协议,通过持续监测单孔的阻抗,同时逐步增加激动剂浓度,从而记录培养细胞单层中配体诱导GPCR活化的全剂量-反应曲线。序列激动剂添加方案显著提高了每口井的通量,从一种浓度增加到10个或更多浓度,如目前人类U-373 MG细胞的例子所示,该细胞内分泌表达组胺1受体(H1R)。因此,该方法有可能在无标签剂量反应研究中显著提高吞吐量,同时将时间分辨率保持在仪器最大值。
该协议描述了一种无标签阻抗测量方法,以确定在无电激动剂诱导的GPCR活化或存在同一受体的特定拮抗剂时的剂量-反应关系。该方法的概念证明在最近出版的第12号出版物中提出。据我们所知,这是第一个研究描述使用体外单细胞层建立激动剂介导的GPCR活化的全剂量反应曲线。该方法不可避免地需要使用无标签细胞监测方法,并且不适用于端点检测。
该协…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢芭芭拉·戈里克尼克和娜贾·辛特瑞特在细胞培养和实验解决方案的制备方面提供帮助。作者感谢研究培训小组1910年”选择性GPCR配体药物化学”的财政支持,由德国研究基金会(DFG)资助,赠款号为222125149。JAS特别感谢巴伐利亚性别平等方案提供的奖学金。
Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | ||
8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) | |
96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area | |
Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
Micropipette large (100 – 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
Micropipette large (20 – 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) |