अंतर ट्राइप्सिनाइजेशन द्वारा मोज़ेक मैमेरी ऑर्गेनॉइड की पीढ़ी
Summary
मैममैरी ग्रंथि एक द्विस्तरीय संरचना है, जिसमें बाहरी मायोपिथेलियल और आंतरिक चमकदार एपिथेलियल कोशिकाएं शामिल हैं। प्रस्तुत अंतर ट्राइप्सिनाइजेशन का उपयोग करऑर्गेनॉइड तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। यह कुशल विधि शोधकर्ताओं को मैमेरी ग्रंथि और कार्य में अपनी भूमिकाओं से संबंधित प्रश्नों का पता लगाने के लिए इन दो सेल प्रकारों में अलग से हेरफेर करने की अनुमति देती है।
Abstract
ऑर्गेनॉइड आत्म-आयोजन, त्रि-आयामी ऊतक संरचनाएं प्रदान करते हैं जो एक डिश की सुविधा में शारीरिक प्रक्रियाओं को फिर से तैयार करते हैं। मूत्र मैमरी ग्रंथि दो अलग-अलग एपिथेलियल सेल डिब्बों से बना है, जो विभिन्न कार्यों की सेवा करता है: बाहरी, अनुबंधित मायोपिथेलियल डिब्बे और आंतरिक, गुप्त चमकदार डिब्बे। यहां, हम एक विधि का वर्णन करते हैं जिसके द्वारा इन डिब्बों को शामिल करने वाली कोशिकाओं को अलग-थलग कर दिया जाता है और फिर स्तन ग्रंथि मॉर्फोजेनेसिस और भेदभाव के लिए उनके व्यक्तिगत वंश योगदान की जांच करने के लिए संयुक्त किया जाता है। विधि सरल और कुशल है और फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई जैसी परिष्कृत पृथक्करण प्रौद्योगिकियों की आवश्यकता नहीं है। इसके बजाय, हम ऊतक को काटते हैं और एंजाइमैटिक रूप से पचाते हैं, अनुयायी ऊतक संस्कृति व्यंजनों पर एपिथेलियम को बीज देते हैं, और फिर ~ 90% शुद्धता के साथ चमकदार कोशिकाओं से मायोपिथेलियाल को अलग करने के लिए अंतर ट्राइप्सिनाइजेशन का उपयोग करते हैं। कोशिकाओं को तब एक बाह्युलर मैट्रिक्स में चढ़ाया जाता है जहां वे द्विस्तरीय, त्रि-आयामी (3 डी) ऑर्गेनोइड में व्यवस्थित होते हैं जिन्हें संस्कृति में 10 दिनों के बाद दूध का उत्पादन करने के लिए विभेदित किया जा सकता है। आनुवंशिक उत्परिवर्तन के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए, कोशिकाओं को जंगली प्रकार या आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल से काटा जा सकता है, या उन्हें 3 डी संस्कृति से पहले आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग मोज़ेक ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है जो विशेष रूप से चमकदार या मायोपिथेलियल डिब्बे में जीन कार्य की जांच की अनुमति देता है।
Introduction
मैमेरी ग्रंथि (एमजी) एक पेड़ की तरह, ट्यूबलर एपिथेलियल संरचना है जो एक आदिपोसाइट रिच स्ट्रोमा के भीतर एम्बेडेड है। बाइलेयरड डक्टल एपिथेलियम में संकुचन की एक बाहरी, बेसल परत, मायोपिथेलियल कोशिकाएं (मायोईसी) और ल्यूमिनल, गुप्त एपिथेलियल कोशिकाओं (एलईसी) की एक आंतरिक परत शामिल है, जो केंद्रीय लुमेन1को घेर रही है। स्तनपान के दौरान जब बाहरी मायोईसी आंतरिक अल्वेलर एलईसी से दूध निचोड़ने के लिए अनुबंध करते हैं, तो एमजी कई परिवर्तनों से गुजरता है जो विकास कारकों (जैसे, ईजीएफ और एफजीएफ) और हार्मोन (जैसे प्रोजेस्टेरोन, इंसुलिन और प्रोलैक्टिन) के नियंत्रण में हैं। ये परिवर्तन विशेष संरचनाओं, अल्वेली के भेदभाव का कारण बनते हैं, जो स्तनपानकेदौरान दूध का संश्लेषण और स्रावित करते हैं। मैमरियल एपिथेलिया को प्रयोगात्मक रूप से तकनीकों का उपयोग करके हेरफेर किया जा सकता है जिसमें या तो एपिथेलियल ऊतक के टुकड़े, कोशिकाएं, या यहां तक कि एक बेसल सेल को मेजबान मैमरियल फैट पैड में प्रत्यारोपित किया जाता है, जो एंडोजेनस मैमरियल पैरानचिमा से पहले से ही निकाला जाता है, और एक संपूर्ण, कार्यात्मक एपिथेलियल ट्री2,33,44,5का पुनर्गठन करने के लिए बाहर बढ़ने की अनुमति देता है।, प्रत्यारोपण एक शक्तिशाली तकनीक है, लेकिन यह समय लेने वाली और असंभव है यदि प्रारंभिक भ्रूणीय घातकता (E14 से पहले) में उत्परिवर्तन का परिणाम है जो प्रत्यारोपण योग्य स्तन एंलेज के बचाव को रोकता है। इसके अलावा, जांचकर्ता अक्सर दो अलग-अलग डिब्बों की भूमिकाओं पर शोध करना चाहते हैं, जो वंश-प्रतिबंधित जनक कोशिकाओं से प्राप्त होते हैं। जबकि क्रे-लोक्स प्रौद्योगिकी मायोईसी और एलईसी के अंतर आनुवंशिक हेरफेर की अनुमति देती है, यह भी एक समय लेने वाली और महंगी उपक्रम है। इस प्रकार, 1 9 50 के दशक के बाद से, जांचकर्ताओं ने मैमरी ऊतक संरचना और कार्य6,,7से संबंधित प्रश्नों को संबोधित करने के अपेक्षाकृत आसान और कुशल तरीके के रूप में विट्रो मैमेरी ऑर्गेनॉइड में उपयोग किया है।
प्राथमिक स्तन एपिथेलियल कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति का वर्णन करते हुए प्रारंभिक प्रोटोकॉल में, जांचकर्ताओं ने पाया कि प्लाज्मा क्लॉट और चिकन भ्रूण निकालने से बना एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (बीएमई), एक डिश6पर उगाए गए एमजी के टुकड़ों के लिए आवश्यक था। अगले दशकों में, एंगेलब्रेथ-होल्म-वार्म मर्मूत्र सारकोमा कोशिकाओं द्वारा स्रावित एक्सट्रासेलुलर मैट्रिस (ईसीएमएस, कोलेजन, और जेलीनुमा प्रोटीन मैट्रिक्स) को 3 डी संस्कृति की सुविधा और वीवो पर्यावरण7,8,,99,10में बेहतर नकल करने के लिए विकसित किया गया था।, 3 डी मैट्रिस में कोशिकाओं को कई मानदंडों (आकृति विज्ञान, जीन अभिव्यक्ति और हार्मोन जवाबदेही) द्वारा प्रकट किया गया है कि वीवो शारीरिक प्रक्रियाओंमेंइस तरह के माइक्रोएनवायरमेंट बेहतर मॉडल9,10,,11,,12। प्राथमिक मूत्र कोशिकाओं का उपयोग कर अनुसंधान ने ऑर्गेनॉइड13के विस्तारित रखरखाव और भेदभाव के लिए आवश्यक प्रमुख विकास कारकों और मॉर्फोनजेन की पहचान की । इन अध्ययनों ने यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए मंच निर्धारित किया है, और मानव स्तन कोशिकाओं की संस्कृति के लिए 3 डी ऑर्गेनॉइड के रूप में, जो अब एक आधुनिक नैदानिक उपकरण है, जो रोगी नमूनों पर दवा की खोज और दवा परीक्षण के लिए अनुमति देता है14। कुल मिलाकर, ऑर्गेनोइड क्यूल्चरिंग प्राथमिक कोशिकाओं की आत्म-संगठन क्षमताओं और मॉर्फोजेनेसिस और भेदभाव में उनके योगदान पर प्रकाश डालती है।
यहां प्रस्तुत संस्कृति मूत्र एपिथेलिया के लिए एक प्रोटोकॉल है जिसे दूध उत्पादक एसीनी में विभेदित किया जा सकता है। मायोईसी और एलईसी को अलग करने के लिए एक अंतर ट्राइप्सिनाइजेशन तकनीक का उपयोग किया जाता है जिसमें दो अलग-अलग एमजी सेल डिब्बे शामिल होते हैं। इन अलग सेल अंशों तो आनुवंशिक रूप से ओवरएक्सप्रेस या नॉकआउट जीन समारोह के लिए हेरफेर किया जा सकता है । क्योंकि वंश-आंतरिक, आत्म-संगठन मैममैरी एपिथेलियल कोशिकाओं की एक सहज संपत्ति है15,,16,,17,इन कोशिका अंशों को फिर से जोड़ना शोधकर्ताओं को बाइलेयर, मोज़ेक ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करने की अनुमति देता है। हम उत्साहपूर्वक एडीपोस ऊतक को पचाने से शुरू करते हैं, और फिर 24 घंटे(चित्रा 1)के लिए ऊतक संस्कृति पकवान पर स्तन के टुकड़ों को इनक्यूबेटिंग करते हैं। ऊतक के टुकड़े पॉलीस्टीरिन व्यंजनों पर वेवो संगठन में उनके साथ बाइलेयर टुकड़ों के रूप में व्यवस्थित होते हैं: आंतरिक चमकदार परतों के आसपास बाहरी मायोपिथेलियल परत। यह सेलुलर संगठन ट्राइप्सिन-ईडीटीए (0.05%) द्वारा बाहरी मायोईक्स के अलगाव के लिए अनुमति देता है 3-6 मिन के लिए उपचार के बाद ट्राइप्सिन-EDTA (0.05%) उपचार जो शेष आंतरिक एलईसी(चित्रा 2)को अलग करता है। इस प्रकार, विभिन्न ट्राइप्सिन संवेदनशीलता वाले इन सेल प्रकारों को अलग-थलग कर दिया जाता है और बाद में ईसीएम(चित्रा 3)में मिश्रित और चढ़ाया जा सकता है। कोशिकाओं को द्विपक्षीय क्षेत्रबनाने के लिए स्व-संगठन से गुजरना पड़ता है, जिसमें आंतरिक एलईसी के आसपास के मायोईसी की बाहरी परत शामिल होती है। ल्यूमेन गठन तब होता है जब कोशिकाएं विकास कारकों के कॉकटेल वाले माध्यम में बढ़ती हैं (विकास मध्यम के लिए व्यंजनों को देखें)13। 5 दिनों के बाद, ऑर्गेनॉइड को अल्वेलोजेनेसिस मीडियम (व्यंजनों और चित्रा 3Fदेखें) पर स्विच करके दूध उत्पादक एसीनी में अंतर किया जा सकता है और एक और 5 दिनों के लिए इनक्यूबेट किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, ऑर्गेनॉइड का विस्तार और कम से कम 10 दिनों के लिए विकास माध्यम में शाखा जारी रहेगा। ऑर्गेनॉइड का विश्लेषण इम्यूनोफ्लोरेसेंस(चित्रा 3डी-एफ)का उपयोग करके किया जा सकता है या रिकवरी समाधान (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके ईसीएम से जारी किया जा सकता है और अन्य तरीकों (जैसे, इम्यूनोब्लास्ट, आरटी-क्यूपीसीआर) के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, एक विधि का ब्यौरा प्रस्तुत किया जाता है कि शोधकर्ता प्राथमिक एमजी कोशिकाओं का उपयोग करके 3डी ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों को कैसे उत्पन्न कर सकते हैं। इस और अन्य प्रोटोकॉल के बीच अंतर यह है कि हम दो, अलग ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सांताक्रूज़ (UCSC) स्टेम सेल (IBSC) के जीव विज्ञान के लिए संस्थान से तकनीकी सहायता और कोर समर्थन के लिए बेन Abrams शुक्रिया अदा करते हैं । हम सुसान स्ट्रोम और बिल सैक्सटन को उनके सोलमात्र स्पिनिंग डिस्क कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को छात्र विकास (एचएम) को अधिकतम करने की पहल के लिए एनआईएच (एनआईएच GM058903) से जेम्स एच गिलम फैलोशिप फॉर एडवांस्ड स्टडी प्रोग्राम (एसआर) के माध्यम से हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट से यूसीएससी को अनुदान द्वारा समर्थन दिया गया था । एक स्नातक अनुसंधान फैलोशिप के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (O.C. DGE १३३९०६७) और यूसी-कैंसर अनुसंधान समन्वय समिति (एलएच) से एक अनुदान (A18-0370) द्वारा ।
Materials
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
Referências
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