차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성
Summary
유방 동맥은 외부 근상피 및 내부 발광 상피 세포를 포함하는 이중 층 구조입니다. 제시된 것은 차동 트립시니화를 이용하여 오르가노이드를 준비하는 프로토콜이다. 이 효율적인 방법은 연구원이 별도로 유선 양식 및 기능에 있는 그들의 역할에 관하여 질문을 탐구하기 위하여 이 2개의 세포 모형을 조작하는 것을 허용합니다.
Abstract
오르가노이드는 접시의 편리함으로 생리적 과정을 재연하는 자가 조직, 3차원 조직 구조를 제공합니다. 뮤린 유방 동맥은 두 개의 별개의 상피 세포 구획으로 구성되어 있으며, 외부, 수축성 근상피 구획 및 내부, 분비 발광 구획과 같은 서로 다른 기능을 제공합니다. 여기에서, 우리는 이 구획을 포함하는 세포가 유방 선 형태 형성 및 분화에 그들의 개별 적인 혈통 기여를 조사하기 위하여 단리되고 그 때 결합되는 방법을 기술합니다. 이 방법은 간단하고 효율적이며 형광 활성화 세포 선별과 같은 정교한 분리 기술이 필요하지 않습니다. 대신, 우리는 조직을 수확하고 효소적으로 소화하고, 부착 조직 배양 접시에 상피를 씨를 뿌린 다음 차동 트립시니화를 사용하여 ~ 90 % 순도의 발광 세포에서 근상추신을 분리합니다. 세포는 그 때 배양에 있는 10 일 후에 우유를 생성하기 위하여 분화될 수 있는 이중층, 3차원 (3D) organoids로 조직되는 세포외 매트릭스에서 그 때 도금됩니다. 유전 돌연변이의 효력을 시험하기 위하여는, 세포는 야생 모형 또는 유전으로 조작한 마우스 모형에서 수확될 수 있습니다, 또는 3D 문화 전에 유전으로 조작될 수 있습니다. 이 기술은 발광 또는 근상피 구획에서 특히 유전자 기능의 조사를 허용하는 모자이크 오르가노이드를 생성하는 데 사용될 수 있습니다.
Introduction
유방 선 (MG)는 지방세포가 풍부한 기질 안에 내장 된 나무 와 같은 관 상피 구조입니다. 이중층 덕트 상피는 수축성, 근상피세포(MyoECs) 및 중추세포의 내층, 분비상피세포(LEC)의 외부, 기저층을 포함하며, 중앙 루멘1을둘러싸고 있다. 외부 MyoECs 내부 폐포 LECs에서 우유를 짜내기 위해 계약 하는 동안 수 유 하는 동안, MG 성장 인자 (예를 들어, EGF 와 FGF) 그리고 호르몬 (예를 들어, 프로게스테론, 인슐린, 그리고 prolactin)의 통제 하에 수많은 변화를 겪는다. 이러한 변화는 수유 중 우유를 합성하고 분비하는 특수 구조인 폐포의 분화를 유발합니다1. 유방 상피계는 실험적으로 상피 조직 단편, 세포, 또는 단일 기저 세포가 숙주 유방 지방 패드로 이식되는 기술을 사용하여 조작될 수 있으며, 내인성 유방 parenchyma의 사전 제거, 전체, 기능상피트리2,,3,,4,,5를재구성하기 위해 성장하도록 허용된다. 이식은 강력한 기술이지만, 돌연변이가 초기 배아 치사(E14 이전)를 초래하여 이식 가능한 유방 조개 배의 구조를 방해하는 경우 시간이 많이 걸리고 불가능합니다. 게다가, 조사자는 수시로 계보 제한한 전구 세포에서 파생되는 2개의 다른 구획의 역할을 연구하고 싶습니다. Cre-lox 기술은 MyoECs및 LEC의 차등 유전자 조작을 허용하지만, 이것은 또한 시간과 비용이 많이 드는 사업입니다. 따라서, 1950년대 이후, 조사자들은 유선 조직 구조 및 기능에 관한 질문을 비교적 쉽고 효율적으로 해결하는 방법으로 시험관내 유방 유기체를사용해 왔으며6,7.
1차 유방 상피 세포의 분리 및 배양을 설명하는 초기 프로토콜에서, 연구자들은 플라즈마 혈전과 닭 배아 추출물로 구성된 지하 막 매트릭스(BME)가 접시에서 자란 MG 단편에 필요하다는 것을발견하였다 6. 다음 십년간에서, 세포외 매트릭스(Engelbreth-Holm-Swarm murine 육종 세포에 의해 분비된 EMS, 콜라겐 및 젤리같은 단백질 매트릭스)는 3D 배양을 촉진하고 생체 내 환경7,,8,,9,,10을더 잘 모방하기 위해 개발되었다. 3D 행렬에서 세포를 배양하는 것은 생체 내 생리학적과정9,,10,,11,,12에서이러한 미세환경이 더 나은 모델이라는 여러 기준(형태학, 유전자 발현 및 호르몬 반응성)에 의해 밝혀졌다. 1차 뮤린 세포를 이용한 연구는 오르가노이드의 확장된 유지 및 분화에 필요한 주요 성장 인자 및 모르포겐을확인하였다 13. 이러한 연구는 여기에 제시된 프로토콜에 대한 무대를 설정하고, 인간 유방 세포의 배양을 3D 오르가노이드로, 이는 현재 현대 임상 도구이며, 환자 샘플에 대한 약물 발견 및 약물 검사를 허용한다14. 전반적으로, 오르가노이드 배양은 1 차적인 세포의 자기 조직 수용량 및 형태 형성과 분화에 그들의 기여를 강조합니다.
여기서 제시된 것은 우유 생성 아시니로 분화될 수 있는 배양 뮤린 상피에 대한 프로토콜이다. 차동 트립시네화 기술은 2개의 별개의 MG 세포 구획을 구성하는 MyoECs 및 LECs를 격리하기 위하여 이용됩니다. 이 분리된 세포 분획은 그 때 유전자 기능을 과발현하거나 녹다운하기 위하여 유전으로 조작될 수 있습니다. 계보-내재성, 자기 조직은 유방 상피 세포의 타고난 속성이기 때문에15,,16,,17,이러한 세포 분획을 재조합하면 연구자들은 이중층, 모자이크 오르가노이드를 생성할 수 있다. 우리는 효소적으로 지방 조직을 소화하고 24 시간 동안 조직 배양 접시에 유방 조각을 배양하는 것으로 시작합니다(그림 1). 조직 단편은 생체 내 조직과 이중 층 조각으로 폴리스티렌 접시에 정착 : 내부 발광 층을 둘러싼 외부 근상피층 층. 이러한 세포 조직은 트립신-EDTA(0.05%)에 의한 외부 MyoECs의 격리를 허용합니다. 3-6분 동안 트립신-EDTA 2라운드(0.05%) 남은 내부 LES를 분리하는치료(그림 2). 따라서, 상이한 트립신 감도를 가진 이들 세포 유형은 단리되고 이후에 ECM에서 혼합 및 도금될 수있다(도 3). 세포는 내부 LEC를 둘러싼 MyoECs의 외부 층을 포함하는 이중 층구를 형성하기 위하여 자기 조직을 겪습니다. 루멘 형성은 세포가 성장 인자의 칵테일을 포함하는 배지에서 성장함에 따라 발생 (성장 매체에 대한 조리법 참조)13. 5일 후, 오르가노이드는 알베올로제네시스 배지(레시피 및 도 3F참조)로 전환하여 우유 생산 아시니로 분화하고 또 다른 5일 동안 배양할 수 있다. 대안적으로, 오르가노이드는 적어도 10일 동안 성장 배지에서 계속 확장및 분기될 것이다. 오르가노이드는 면역형광(도3D-F)을이용하여 분석하거나 회복용액을 사용하여 ECM으로부터 방출될 수 있다(물질표참조)하고 다른 방법들(예를 들어, 면역블롯, RT-qPCR)을 통해 분석될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서, 연구원은 1 차적인 MG 세포를 사용하여 3D organoid 문화를 생성할 수 있는 방법을 상세히 제시됩니다. 이 프로토콜과 다른 프로토콜의 차이점은 두 개의 별개의 MG 세포 구획인 외부 기저 MyoECs 및 내부 LEC를 분리하는 방법을 자세히 설명한다는 것입니다. 우리의 방법은 2 단계 트립신 EDTA (0.05 %)를 채택 우리가 차등 트립시니화 라고 하는 치료19. 이 절차는 연구원이 정교한 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 캘리포니아 대학에서 기술 지원 및 핵심 지원을 벤 아브람스 감사합니다, 산타 크루즈 (UCSC) 줄기 세포의 생물학 연구소 (IBSC). 우리는 그들의 솔라미어 회전 디스크 공초점 현미경의 사용에 대한 수잔 스트롬과 빌 색스턴 감사합니다. 이 작품은 고등 연구 프로그램에 대한 제임스 H. 길리엄 펠로우십을 통해 하워드 휴즈 의학 연구소에서 UCSC에 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다 (S.R.), NIH에서 (NIH GM058903) 학생 개발을 극대화하기위한 이니셔티브에 대한 (H.M.) 대학원 연구 펠로우십 (O.C. DGE 1339067)과 UC-암 연구 조정위원회 (LH)의 보조금 (A18-0370)에 의해 국립 과학 재단.
Materials
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
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