Generación de organoides mamarios de mosaico por trippsinización diferencial
Summary
La glándula mamaria es una estructura bicapa, que comprende células epiteliales mioepiteliales externas e internas. Presentado es un protocolo para preparar organoides utilizando la trippsinización diferencial. Este método eficiente permite a los investigadores manipular por separado estos dos tipos de células para explorar preguntas sobre sus funciones en la forma y función de la glándula mamaria.
Abstract
Los organoides ofrecen estructuras de tejido tridimensionales autoorganizadas que recapitulan los procesos fisiológicos en la comodidad de un plato. La glándula mamaria murina se compone de dos compartimentos celulares epiteliales distintos, que cumplen diferentes funciones: el compartimento mioepitelial externo y contractilo y el compartimento luminal interior y secretor. Aquí, describimos un método por el cual las células que componen estos compartimentos se aíslan y luego se combinan para investigar sus contribuciones individuales de linaje a la morfogénesis y diferenciación de la glándula mamaria. El método es simple y eficiente y no requiere tecnologías de separación sofisticadas como la clasificación celular activada por fluorescencia. En su lugar, cosechamos y digerimos enzimáticamente el tejido, sembramos el epitelio en platos de cultivo de tejidoadherente, y luego usamos trippsinización diferencial para separar el mioepitelial de las células luminales con una pureza del 90 %. Las células se platean en una matriz extracelular donde se organizan en organoides bicapados tridimensionales (3D) que se pueden diferenciar para producir leche después de 10 días en cultivo. Para probar los efectos de las mutaciones genéticas, las células se pueden cosechar a partir de modelos de ratón de tipo salvaje o genéticamente diseñados, o pueden ser manipuladas genéticamente antes del cultivo 3D. Esta técnica se puede utilizar para generar organoides de mosaico que permiten la investigación de la función génica específicamente en el compartimento luminal o mioepitelial.
Introduction
La glándula mamaria (MG) es una estructura epitelial tubular similar a un árbol incrustada dentro de un estroma rico en adipocitos. El epitelio ductal bicapado comprende una capa externa basal de células contráctil, mioepiteliales (MyoEC) y una capa interna de células epiteliales luminarias y secretoras (LEC), que rodea un lumen central1. Durante la lactancia cuando los MyoECexternos externos se contraen para exprimir la leche de los LEC alveolares internos, la MG sufre numerosos cambios que están bajo el control de factores de crecimiento (por ejemplo, EGF y FGF) y hormonas (por ejemplo, progesterona, insulina y prolactina). Estos cambios causan la diferenciación de las estructuras especializadas, alvéolos, que sintetizan y secretan la leche durante la lactancia1. La epitelía mamaria puede ser manipulada experimentalmente utilizando técnicas en las que los fragmentos de tejido epitelial, las células o incluso una sola célula basal se trasplantan en almohadillas de grasa mamaria del huésped, precleares del parénquima mamario endógeno, y se les permite crecer para reconstituir un árbol epitelial completo y funcional2,,3,4,5. El trasplante es una técnica poderosa, pero es lenta e imposible si una mutación resulta en una letalidad embrionaria temprana (antes de E14) que evita el rescate del anlage mamario trasplanible. Además, los investigadores con frecuencia desean investigar las funciones de los dos compartimentos diferentes, que se derivan de células progenitoras restringidas al linaje. Si bien la tecnología Cre-lox permite la manipulación genética diferencial de myoECs y LECs, también es una tarea costosa y que consume mucho tiempo. Así, desde la década de 1950, los investigadores han utilizado organoides mamarios in vitro como una manera relativamente fácil y eficiente de abordar cuestiones relativas a la estructura y función del tejido mamario6,7.
En los primeros protocolos que describen el aislamiento y el cultivo de células epiteliales mamarias primarias, los investigadores encontraron que se requería una matriz de membrana de sótano (BME), compuesta por un coágulo plasmático y extracto de embrión de pollo, para los fragmentos de MG cultivados en un plato6. En las décadas siguientes, se desarrollaron matrices extracelulares (ECM, colágeno y matriz proteica gelatinosa secretada por células de sarcoma murino Engelbreth-Holm-Swarm) para facilitar el cultivo 3D e imitar mejor el entorno in vivo7,,8,9,10. Células de cultivo en matrices 3D reveladas por múltiples criterios (morfología, expresión génica y capacidad de respuesta hormonal) que tal microambiente modela mejor los procesos fisiológicos vivos9,10,11,12. La investigación utilizando células murinas primarias identificó factores clave de crecimiento y morógenos necesarios para el mantenimiento extendido y la diferenciación de organoides13. Estos estudios han establecido el escenario para el protocolo presentado aquí, y para el cultivo de células mamarias humanas como organoides 3D, que ahora es una herramienta clínica moderna, lo que permite el descubrimiento de fármacos y pruebas de drogas en muestras de pacientes14. En general, el cultivo organoide retocomodo pone de relieve las capacidades de autoorganización de las células primarias y sus contribuciones a la morfogénesis y diferenciación.
Presentado aquí es un protocolo para el cultivo de la epitelia murina que se puede diferenciar en acini productor de leche. Se utiliza una técnica de tripinización diferencial para aislar los MyoECs y LEC que componen los dos compartimentos celulares MG distintos. Estas fracciones celulares separadas pueden ser manipuladas genéticamente para sobreexpresar o derribar la función genética. Debido a que el linaje-intrínseco, la autoorganización es una propiedad innata de las células epiteliales mamarias15,16,17, la recombinación de estas fracciones celulares permite a los investigadores generar bicapas, organoides de mosaico. Comenzamos digiriendo enzimáticamente el tejido adiposo, y luego incubando los fragmentos mamarios en un plato de cultivo de tejido durante 24 h(Figura 1). Los fragmentos de tejido se asientan sobre platos de poliestireno como fragmentos bicapados con su organización in vivo: capa mioepitelial exterior que rodea las capas luminales internas. Esta organización celular permite el aislamiento de los MyoECexternos externos por trippsina-EDTA (0,05%) tratamiento durante 3-6 min seguido de una segunda ronda de trypsin-EDTA (0,05%) tratamiento que separa los LEC internos restantes(Figura 2). Por lo tanto, estos tipos de células con diferente sensibilidad a la trippsina se aíslan y posteriormente se pueden mezclar y chapar en ECM(Figura 3). Las células se someten a una autoorganización para formar esferas bicapas, que comprenden una capa externa de Micmy que rodean los LEC internos. La formación de lúmenes se produce a medida que las células crecen en un medio que contiene un cóctel de factores de crecimiento (ver recetas para el medio de crecimiento)13. Después de 5 días, los organoides se pueden diferenciar en acini productores de leche cambiando a Medio de Alveologénesis (ver recetas y Figura 3F)e incubados durante otros 5 días. Alternativamente, los organoides continuarán expandiéndose y ramificándose en el Medio de Crecimiento durante al menos 10 días. Los organoides pueden analizarse utilizando inmunofluorescencia(Figura 3D-F)o liberarse del ECM utilizando una solución de recuperación (ver Tabla de Materiales)y analizarse a través de otros métodos (por ejemplo, inmunoblot, RT-qPCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, se presenta un método que detalla cómo los investigadores pueden generar cultivos organoides 3D utilizando células MG primarias. La diferencia entre este y otros protocolos es que detallamos un método para separar los dos compartimentos celulares MG distintos: los Miciscos basales externos y los LEC internos. Nuestro método emplea una trippsina-EDTA de dos pasos (0,05%) tratamiento que llamamos trippsinización diferencial19. Este procedimiento permite a los investigadores aislar MyoEC…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Ben Abrams por la asistencia técnica y el apoyo básico del Instituto de La Universidad de California, Santa Cruz (UCSC) para la Biología de las Células Madre (IBSC). Agradecemos a Susan Strome y Bill Saxton por el uso de su solamere Spinning Disk Confocal Microscope. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones a la UCSC del Instituto Médico Howard Hughes a través del programa James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study (S.R.), del NIH (NIH GM058903) para la iniciativa de maximizar el desarrollo estudiantil (H.M.) y de la NIH (NIH GM058903) para la iniciativa de maximizar el desarrollo estudiantil (H.M.) y de la NIH (NIH GM058903) para la iniciativa de maximizar el desarrollo estudiantil (H.M.) y desde la Fundación Nacional de Ciencias para una beca de investigación de posgrado (O.C. DGE 1339067) y por una beca (A18-0370) del Comité coordinador de investigación del cáncer de UC (LH).
Materials
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
Referências
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