Geração de Organóides Mammary mosaicos por Trypsinização Diferencial
Summary
A glândula mamária é uma estrutura bicamada, composta por células epiteliais mioepiteleliais externas e internas. Apresentado é um protocolo para preparar organóides utilizando a tripspsinização diferencial. Este método eficiente permite que os pesquisadores manipulem separadamente esses dois tipos de células para explorar questões sobre seus papéis na forma e função da glândula mamária.
Abstract
Organóides oferecem estruturas de tecidos tridimensionais auto-organizadas que recapitulam processos fisiológicos na conveniência de um prato. A glândula mamária murina é composta por dois compartimentos de células epiteliais distintos, servindo funções diferentes: o compartimento mioepitelal externo e contraído e o compartimento luminal interno e secreto. Aqui, descrevemos um método pelo qual as células que compõem esses compartimentos são isoladas e, em seguida, combinadas para investigar suas contribuições individuais de linhagem para morfogemeee e diferenciação da glândula mamária. O método é simples e eficiente e não requer tecnologias sofisticadas de separação, como a triagem celular ativada por fluorescência. Em vez disso, colhemos e digerimos enzimáticamente o tecido, sedeo o epitélio em pratos de cultura de tecido aderente e, em seguida, usamos a tripsinização diferencial para separar o mioepitelial das células luminais com ~90% de pureza. As células são então banhadas em uma matriz extracelular onde se organizam em organóides bicamadas tridimensionais (3D) que podem ser diferenciadas para produzir leite após 10 dias na cultura. Para testar os efeitos das mutações genéticas, as células podem ser colhidas de modelos de camundongos selvagens ou geneticamente modificados, ou podem ser geneticamente manipuladas antes da cultura 3D. Esta técnica pode ser usada para gerar organóides de mosaico que permitem a investigação da função genética especificamente no compartimento luminal ou mioepitelélico.
Introduction
A glândula mamária (MG) é uma estrutura epitelia tubular em forma de árvore embutida dentro de um estroma rico em adrócitos. O epitélio ductal bicamada compreende uma camada externa, basal de contratura, células mioepitelélicas (MioECs) e uma camada interna de células epiteliais luminais e secretas (LECs), circundando um lúmen central1. Durante a lactação quando os MyoECs externos se contraem para espremer leite dos LECs alveolares internos, o MG sofre inúmeras alterações que estão o controle de fatores de crescimento (por exemplo, EGF e FGF) e hormônios (por exemplo, progesterona, insulina e prolactina). Essas alterações causam a diferenciação de estruturas especializadas, aveoli, que sintetizam e secretam o leite durante a lactação1. A epitelia mamária pode ser manipulada experimentalmente usando técnicas nas quais fragmentos de tecido epitelial, células ou mesmo uma única célula basal são transplantados em almofadas de gordura mamária hospedeira, pré-limpas de parênquima mamária endógena, e permitidas a crescer para reconstituir uma árvore epitelial completaefuncional 2,3,4,5. O transplante é uma técnica poderosa, mas é demorada e impossível se uma mutação resultar em letalidade embrionária precoce (antes do E14) que impede o resgate de anlaga mamária transplantável. Além disso, os pesquisadores frequentemente desejam pesquisar os papéis dos dois compartimentos diferentes, que são derivados de células progenitoras restritas à linhagem. Embora a tecnologia Cre-lox permita a manipulação genética diferencial de MyoECs e LECs, esta também é uma empresa demorada e cara. Assim, desde a década de 1950, os pesquisadores têm usado organóides mamários in vitro como uma maneira relativamente fácil e eficiente de abordar questões relativas à estrutura e função do tecido mamário6,7.
Nos protocolos iniciais que descrevem o isolamento e a cultura das células epiteliais mamárias primárias, os pesquisadores descobriram que uma matriz de membrana de porão (BME), composta por um coágulo de plasma e extrato de embrião de frango, era necessária para fragmentos de MG cultivados em um prato6. Nas décadas seguintes, matrizes extracelulares (ECMs, colágeno e matriz de proteínas geleias secretadas por células de sarcoma de murina Engelbreth-Holm-Swarm) foram desenvolvidas para facilitar a cultura 3D e imitar melhor o ambiente in vivo7,8,9,10. O cultivo de células em matrizes 3D revelou por múltiplos critérios (morfologia, expressão genética e resposta hormonal) que tal microambiente melhor modela em processos fisiológicos vivos9,,10,,11,12. Pesquisas utilizando células murinaprimárias identificaram fatores-chave de crescimento e morfogênios necessários para a manutenção prolongada e diferenciação dos organóides13. Esses estudos prepararam o cenário para o protocolo aqui apresentado, e para a cultura das células mamárias humanas como organóides 3D, que hoje é uma ferramenta clínica moderna, permitindo a descoberta de medicamentos e testes de drogas em amostras de pacientes14. No geral, a cultura organóide destaca as capacidades de auto-organização das células primárias e suas contribuições para a morfogênese e diferenciação.
Apresentado aqui é um protocolo para a epiteria murina cultural que pode ser diferenciada em acini produtor de leite. Uma técnica diferencial de trypsinização é usada para isolar os MyoECs e LECs que compõem os dois compartimentos celulares MG distintos. Essas frações de células separadas podem então ser geneticamente manipuladas para superexpressá-la ou derrubar a função genética. Como a linhagem intrínseca, a auto-organização é uma propriedade inata das células epiteliais mamárias15,,16,17, recombinando essas frações celulares permite que os pesquisadores gerem organóides bicamadas e mosaicos. Começamos digerindo enzimticamente o tecido adiposo e, em seguida, incubando os fragmentos de mamária em um prato de cultura de tecido por 24 h (Figura 1). Os fragmentos de tecido se instalam em pratos de poliestireno como fragmentos bicamadas com sua organização in vivo: camada mioepitelial externa em torno de camadas luminais internas. Esta organização celular permite o isolamento dos MyoECs externos por trypsin-EDTA (0,05%) tratamento para 3-6 min seguido de uma segunda rodada de trypsin-EDTA (0,05%) tratamento que destaca os LECs internos restantes(Figura 2). Assim, esses tipos de células com sensibilidade à tripsina diferente são isolados e podem, posteriormente, ser misturados e banhados em ECM (Figura 3). As células passam por auto-organização para formar esferas bicamadas, compreendendo uma camada externa de MyoECs em torno de LECs internos. A formação de lúmen ocorre à medida que as células crescem em um meio contendo um coquetel de fatores de crescimento (ver receitas para o Meio de Crescimento)13. Após 5 dias, os organóides podem ser diferenciados em acini produtores de leite, mudando para Alveologenesis Medium (ver receitas e Figura 3F) e incubados por mais 5 dias. Como alternativa, os organóides continuarão a expandir-se e ramificar-se no Meio de Crescimento por pelo menos 10 dias. Os organóides podem ser analisados utilizando imunofluorescência(Figura 3D-F) ou liberados do ECM utilizando uma solução de recuperação (ver Tabela de Materiais) e analisados por outros métodos (por exemplo, imunoblot, RT-qPCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, um método é apresentado detalhando como os pesquisadores podem gerar culturas organóides 3D usando células MG primárias. A diferença entre este e outros protocolos é que detalhamos um método para separar os dois compartimentos de células MG distintos: os MyoECs basais externos e lecs internos. Nosso método emprega uma trypsin-EDTA de duas etapas (0,05%) tratamento que chamamos de trippsinização diferencial19. Este procedimento permite que os pesquisadores isolem MyoECs e LECs sem…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Ben Abrams pela assistência técnica e apoio do Instituto de Biologia de Células-Tronco da Universidade da Califórnia, Santa Cruz (UCSC). Agradecemos a Susan Strome e Bill Saxton pelo uso de seu Microscópio Confocal do Disco Giratório Solamere. Este trabalho foi apoiado em parte por subsídios à UCSC do Howard Hughes Medical Institute através do James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study program (S.R.), do NIH (NIH GM058903) para a iniciativa de maximizar o desenvolvimento estudantil (H.M.) e de a Fundação Nacional de Ciência para uma bolsa de pós-graduação em pesquisa (O.C. DGE 1339067) e por uma bolsa (A18-0370) do Comitê Coordenador de Pesquisa de Câncer da UC (LH).
Materials
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
Referências
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