Summary

Generasjon av Mosaic Mammary Organoids ved differensial trypsinisering

Published: March 11, 2020
doi:

Summary

Brystkjertelen er en bilayered struktur, bestående av ytre myoepitelog indre luminal epitelceller. Presentert er en protokoll for å forberede organoider ved hjelp av differensial trypsinisering. Denne effektive metoden gjør det mulig for forskere å separat manipulere disse to celletypene for å utforske spørsmål om deres roller i brystkjertelform og funksjon.

Abstract

Organoider tilbyr selvorganiserende, tredimensjonale vevsstrukturer som rekapitulerer fysiologiske prosesser i bekvemmeligheten av en tallerken. Murine brystkjertelen består av to forskjellige epitelcellerom, som serverer forskjellige funksjoner: det ytre, kontraktile myoepithelialrommet og det indre, sekretoriske armaturrommet. Her beskriver vi en metode der cellene som består av disse rommene er isolert og deretter kombinert for å undersøke deres individuelle avstamningbidrag til brystkjertelen morfoogenese og differensiering. Metoden er enkel og effektiv og krever ikke sofistikertseparasjonsteknologier som fluorescensaktivert cellesortering. I stedet høster vi og enzymatically fordøye vevet, frø epitelet på tilhengervev sover, og deretter bruke differensial trypsinization å skille myoepithelial fra luminal celler med ~ 90% renhet. Cellene blir deretter belagt i en ekstracellulær matrise hvor de organiserer seg i bilayered, tredimensjonale (3D) organoider som kan differensieres for å produsere melk etter 10 dager i kultur. For å teste effekten av genetiske mutasjoner, celler kan høstes fra vill type eller genmodifiserte musemodeller, eller de kan genetisk manipuleres før 3D kultur. Denne teknikken kan brukes til å generere mosaikkorganoider som tillater undersøkelse av genfunksjon spesielt i luminal eller myoepithelial rommet.

Introduction

Brystkjertelen (MG) er en trelignende, rørformet epitelstruktur innebygd i en adipocyte rik stroma. Det tolagsductal epitelet består av et ytre, basallag av kontraktile, myoepitelceller (MyoECs) og et indre lag av luminale, sekretoriske epitelceller (LECer), som omkranser en sentral lumen1. Under amming når de ytre MyoECs kontrakt for å presse melk fra indre alveolære LECer, MG gjennomgår mange endringer som er under kontroll av vekstfaktorer (f.eks EGF og FGF) og hormoner (f.eks progesteron, insulin, og prolaktin). Disse endringene forårsaker differensiering av spesialiserte strukturer, alveoler, som syntetiserer og utskiller melk under amming1. Mammary epitelkan bli eksperimentelt manipulert ved hjelp av teknikker der enten epitelvev fragmenter, celler, eller til og med en enkelt basal celle er transplantert inn i verten pattedyr fett pads, precleared av endogene bryst parenchyma, og lov til å vokse ut for å rekonstituere en hel, funksjonell epithelial treet2,3,4,5.5 Transplantasjon er en kraftig teknikk, men det er tidkrevende og umulig hvis en mutasjon resulterer i tidlig embryonal dødelighet (før E14) som forhindrer redning av transplanterbare pattedyranlage. Videre ønsker etterforskerne ofte å undersøke rollene til de to forskjellige rommene, som er avledet fra avstamningsbegrensede stamceller. Mens Cre-lox-teknologi tillater differensial genetisk manipulering av MyoECs og LECer, er dette også et tidkrevende og dyrt foretak. Dermed, siden 1950-tallet, har forskerne brukt in vitro mammary organoider som en relativt enkel og effektiv måte å løse spørsmål om brystvevstruktur og funksjon6,7.

I tidlige protokoller som beskriver isolasjon og kultur av primære pattedyr epitelceller, fant forskerne at en kjeller membran matrise (BME), bestående av en plasmablodpropp og kylling embryo ekstrakt, var nødvendig for MG fragmenter dyrket på en tallerken6. I de følgende tiårene ble ekstracellulære matriser (EcMs, kollagen og gelélignende proteinmatrise utskilt av Engelbreth-Holm-Swarm murine sarkomceller) utviklet for å lette 3D-kulturen og bedre etterligne in vivo-miljøet7,8,9,10. Culturing celler i 3D matriser avslørt av flere kriterier (morfologi, genuttrykk, og hormon respons) at et slikt mikromiljø bedre modeller i vivo fysiologiske prosesser9,,10,11,12. Forskning ved hjelp av primære murine celler identifisert viktige vekstfaktorer og morfogener nødvendig for utvidet vedlikehold og differensiering av organoider13. Disse studiene har satt scenen for protokollen presentert her, og for kulturen av menneskelige brystceller som 3D organoider, som nå er et moderne klinisk verktøy, slik at for narkotika oppdagelse og narkotikatesting på pasientprøver14. Samlet sett fremhever organoid kuling selvorganisasjonens kapasiteter av primærceller og deres bidrag til morfogenese og differensiering.

Presentert her er en protokoll til kultur murine epitel som kan differensieres til melkeproduserende acini. En differensialtrypsiniseringsteknikk brukes til å isolere MyoECs og LECer som utgjør de to forskjellige MG-cellerommene. Disse separerte cellefraksjonene kan deretter manipuleres genetisk til overexpress eller knockdown genfunksjon. Fordi avstamning-iboende, selv-organisasjon er en medfødt egenskap av pattedyr epitelceller15,16,17, rekombinere disse celle fraksjoner tillater forskere å generere bilayered, mosaikk organoider. Vi begynner med enzymatically fordøye fettvevet, og deretter inkubere brystfragmentene på en vevkulturrett i 24 timer (Figur 1). Vevsfragmentene legger seg på polystyrenretter som bilayered fragmenter med sin in vivo organisasjon: ytre myoepithelial lag rundt indre luminale lag. Denne mobilorganisasjonen gjør det mulig å isolere de ytre MyoECs ved å trypsin-EDTA (0,05%) behandling i 3-6 min etterfulgt av en andre runde med trypsin-EDTA (0,05%) behandling som løsner de resterende indre LECene (figur 2). Dermed isoleres disse celletypene med forskjellig trypsinfølsomhet og kan deretter blandes og lagres i ECM (figur 3). Cellene gjennomgår selvorganisering for å danne tolagskuler, bestående av et ytre lag av MyoECs rundt indre LECer. Lumen formasjon oppstår som cellene vokser i et medium som inneholder en cocktail av vekstfaktorer (se oppskrifter for VekstMedium)13. Etter 5 dager kan organoider differensieres til melkeproduserende acini ved å bytte til Alveologenesis Medium (se oppskrifter og figur 3F)og inkuberes i ytterligere 5 dager. Alternativt vil organoider fortsette å ekspandere og gren i Vekstmedium i minst 10 dager. Organoider kan analyseres ved hjelp av immunfluorescens (Figur 3D-F) eller frigjøres fra ECM ved hjelp av en gjenopprettingsløsning (se materialtabellen) og analyseres via andre metoder (f.eks. immunblot, RT-qPCR).

Protocol

Alle metoder beskrevet her har blitt godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of California, Santa Cruz. 1. Dag 1: Fordøyelsen av brystkjertelen Forbered deg på å høste MGs fra modne hunnmus 10-14 uker. Utfør høstingen på en åpen benk under aseptiske forhold. Steriliser alle kirurgiske forsyninger, korkplater og pinner ved autoklaving og soaking i 70% alkohol i 20 minutter før operasjonen. Bedøvelse av dyr …

Representative Results

Protokollen som presenteres her beskriver en metode for å undersøke spesifikke avstamningbidrag av pattedyrepitelceller ved å gjøre bruk av mosaikkorganoider. For å oppnå primære murineceller for organoider, må brystkjertelepitelet først isoleres fra den omkringliggende adipocytterrike stroma (Figur 1). Denne prosessen er beskrevet kort her og er også beskrevet i en tidligere publisert studie18. For å få nok celler anbefale…

Discussion

Her presenteres en metode som beskriver hvordan forskere kan generere 3D organoid kulturer ved hjelp av primære MG-celler. Forskjellen mellom dette og andre protokoller er at vi beskriver en metode for å skille de to, distinkte MG-cellerommene: de ytre basal myoecs og indre LECer. Vår metode benytter en to-trinns trypsin-EDTA (0,05%) behandling som vi kaller differensial trypsinization19. Denne prosedyren gjør det mulig for forskere å isolere MyoECs og LECer uten å bruke sofistikert flyt cyt…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Ben Abrams for teknisk assistanse og kjernestøtte fra University of California, Santa Cruz (UCSC) Institute for biologien til stamceller (IBSC). Vi takker Susan Strome og Bill Saxton for bruken av deres Solamere Spinning Disk Confocal Microscope. Dette arbeidet ble delvis støttet av tilskudd til UCSC fra Howard Hughes Medical Institute gjennom James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study program (S.R.), fra NIH (NIH GM058903) for initiativet for å maksimere studentutvikling (H.M.) og fra fra National Science Foundation for et stipendiatstipend (O.C. DGE 1339067) og ved et stipend (A18-0370) fra UC-Cancer Research Coordinating Committee (LH).

Materials

15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) Fisher Scientific 352096
24 well ultra-low attachment plate (Corning) Fisher Scientific CLS3473-24EA
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) Fisher Scientific 353001
50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) Fisher Scientific 352098
60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) Fisher Scientific 353004
70 µM nylon cell strainer (Corning) Fisher Scientific 08-771-2
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062 Pen/Strep also works
B27 supplement without vitamin A (50x) Thermo Fisher Scientific 12587010
B6 ACTb-EGFP mice The Jackson Laboratory 003291
BD Insulin syringe 0.5 mL Thermo Fisher Scientific 14-826-79
Class 2 Dispase (Roche) Millipore Sigma 4942078001
Class 3 Collagenase Worthington Biochemical LS004206
Corning Cell Recovery solution Fisher Scientific 354253 Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures
from Corning Matrigel Matrix
Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well Fisher Scientific CLS3471
Dexamethasone Millipore Sigma D4902-25MG
DMEM/F12, no phenol red Thermo Fisher Scientific 11039-021
DNase (Deoxyribonuclease I) Worthington Biochemical LS002007
Donkey anti-Goat 647 Thermo Fisher Scientific A21447 Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864
Donkey anti-Mouse 647 Jackson ImmunoResearch 715-606-150 Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) Thermo Fisher Scientific 11330-057
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190-250 Without Mg2+/Ca2+
EGF Fisher Scientific AF-100-15-100ug
Fetal Bovine Serum VWR 97068–085 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18
Fluoromount-G (Southern Biotech) Fisher Scientific 0100-01 Referred to as mounting media in text
Gentamicin Thermo Fisher Scientific 15710064
Glycine Fisher Scientific BP381-5
Goat anti-WAP Santa Cruz Biotech SC-14832 Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601
Hoechst 33342 AnaSpec AS-83218 Use 1:2000, stock is 20mM
Insulin Millipore Sigma I6634-100mg
KCl Fisher Scientific P217-500
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
KRT14–CreERtam The Jackson Laboratory 5107
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL Fisher Scientific CB-40230C Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL
MillexGV Filter Unit 0.22 µm Millipore Sigma SLGV033RS
Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile Millipore Sigma PEZGS0816 These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II).
Mouse anti-SMA Millipore Sigma A2547 Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701
N-2 Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 17502048
NaCl Fisher Scientific S671-3
NaH2PO4 Fisher Scientific S468-500
Nrg1 R&D 5898-NR-050
Ovine Pituitary Prolactin National Hormone and Peptide Program Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute
Paraformaldahyde Millipore Sigma PX0055-3
Pentobarbital Millipore Sigma P3761
R26R-EYFP The Jackson Laboratory 6148
Rho inhibitor Y-27632 Tocris 1254
R-spondin Peprotech 120-38
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-500
Sterile Filtered Donkey Serum Equitech-Bio Inc. SD30-0500
Sterile Filtered Donkey Serum Equitech-Bio Inc. SD30-0500
Triton X-100 Millipore Sigma x100-500ML Laboratory grade
Trypsin EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300-062

Referências

  1. Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
  2. Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
  3. Ip, M. M., Asch, B. B. . Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , (2000).
  4. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  5. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  6. Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
  7. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  8. Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
  9. Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
  10. Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
  11. Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message?. Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
  12. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  13. Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207 (2016).
  14. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  15. Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Biologia do Desenvolvimento. 169 (2), 511-519 (1995).
  16. Runswick, S. K., O’Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
  17. Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
  18. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).
  19. Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
  20. Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
  21. Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).
  22. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  23. Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).
  24. Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).
  25. Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
  26. Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).
check_url/pt/60742?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Rubio, S., Cazares, O., Macias, H., Hinck, L. Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization. J. Vis. Exp. (157), e60742, doi:10.3791/60742 (2020).

View Video