Generation af Mosaic Mammary Organoids af Differential Trypsinization
Summary
Mælkekirtlen er en tolaget struktur, bestående af ydre myoepithelial og indre luminale epitelceller. Præsenteret er en protokol til at forberede organoids ved hjælp af differentiale trypsinization. Denne effektive metode gør det muligt for forskere at separat manipulere disse to celletyper til at udforske spørgsmål vedrørende deres roller i mælkekirtlen form og funktion.
Abstract
Organoids tilbyder selvorganiserende, tre-dimensionelle vævstrukturer, der opsummerer fysiologiske processer i bekvemmeligheden af en skål. Murine mælkekirtlen består af to forskellige epitelcellerum, der tjener forskellige funktioner: det ydre, kontraktile myoepitelrum og det indre, sekretoriske luminale rum. Her beskriver vi en metode, hvorved de celler, der omfatter disse rum, isoleres og derefter kombineres for at undersøge deres individuelle afstamningsbidrag til brystkirtel morfogenese og differentiering. Metoden er enkel og effektiv og kræver ikke avancerede separationsteknologier såsom fluorescensaktiveret cellesortering. I stedet høster og enzymatisk fordøje vævet, frø epitel på klæbende væv kultur retter, og derefter bruge differentiale trypsinization at adskille myoepithelial fra luminale celler med ~ 90% renhed. Cellerne er derefter belagt i en ekstracellulær matrix, hvor de organiserer sig i tolagede, tre-dimensionelle (3D) organoids, der kan differentieres til at producere mælk efter 10 dage i kultur. For at teste virkningerne af genetiske mutationer, celler kan høstes fra vilde type eller genetisk manipuleret musemodeller, eller de kan være genetisk manipuleret før 3D-kultur. Denne teknik kan bruges til at generere mosaik organoids, der tillader undersøgelse af genfunktionen specifikt i luminal eller myoepitelrummet.
Introduction
Mælkekirtlen (MG) er en træ-lignende, rørformede epitelstruktur indlejret i en adipocyte rig stroma. Det tolagede ductal epitel består af et ydre, basalt lag af kontraktile, myoepitheliale celler (MyoECs) og et indre lag af luminale, sekretoriske epitelceller (LECs), der omkranser en central lumen1. Under amning, når de ydre MyoECs kontrakt at presse mælk fra den indre alveolær LECs, MG gennemgår talrige ændringer, der er under kontrol af vækstfaktorer (f.eks EGF og FGF) og hormoner (f.eks progesteron, insulin, og prolaktin). Disse ændringer forårsager differentiering af specialiserede strukturer, alveoler, som syntetisere og udskiller mælk under amning1. Den mamma epithelia kan eksperimentelt manipuleres ved hjælp af teknikker, hvor enten epitelvæv fragmenter, celler, eller endda en enkelt basal celle transplanteres i værten mælkefedt puder, præryddet af endogene mammary parenkym, og lov til at vokse ud for at rekonstituere en hel, funktionel epiteltræ2,3,4,5. Transplantation er en kraftfuld teknik, men det er tidskrævende og umuligt, hvis en mutation resulterer i tidlig embryonal dødelighed (før E14), der forhindrer redning af transplanterbar mamma anlage. Desuden ønsker efterforskere ofte at undersøge rollerne for de to forskellige rum, som er afledt af afstamningsbegrænsede sogenitorceller. Mens Cre-lox-teknologien muliggør differentieret genetisk manipulation af MyoECs og LECs, er dette også en tidskrævende og dyr virksomhed. Således har efterforskere siden 1950’erne brugt in vitro mamma organoids som en forholdsvis nem og effektiv måde at behandle spørgsmål vedrørende brystvævstruktur og funktion6,7.
I tidlige protokoller, der beskriver isolering og kultur af primære mælkeepitelceller, fandt efterforskerne, at en kældermembranmatrix (BME), der bestod af en plasmablodprop og kyllingeembryoekstrakt, var påkrævet for MG-fragmenter dyrket på en skål6. I de følgende årtier, ekstracellulære matricer (Ecm’er, kollagen, og jellylike protein matrix udskilles af Engelbreth-Holm-Swarm murine sarkom celler) blev udviklet for at lette 3D-kultur og bedre efterligne in vivo miljø7,8,9,10. Dyrkning af celler i 3D-matricer afsløret af flere kriterier (morfologi, genekspression, og hormon reaktionsevne), at et sådant mikromiljø bedre modeller in vivo fysiologiske processer9,10,11,12. Forskning ved hjælp af primære murineceller identificerede de vigtigste vækstfaktorer og morfogener, der er nødvendige for den udvidede vedligeholdelse og differentiering af organoider13. Disse undersøgelser har sat scenen for protokollen præsenteres her, og for kulturen af menneskelige brystceller som 3D organoider, som nu er et moderne klinisk værktøj, der giver mulighed for lægemiddelopdagelse og lægemiddeltest på patientprøver14. Samlet set, organoid dyrkning fremhæver selv-organisation kapacitet af primære celler og deres bidrag til morfogenese og differentiering.
Præsenteret her er en protokol til kultur murine epithelia, der kan differentieres i mælkeproducerende acini. En differentialtrypsiniseringsteknik bruges til at isolere MyoECs og LECs, der omfatter de to forskellige MG-cellerum. Disse adskilte cellefraktioner kan derefter genetisk manipuleres til overexpress eller knockdown genfunktion. Fordi afstamning-iboende, selv-organisation er en medfødt egenskab af mælkeepitelceller15,16,17, rekombinere disse cellefraktioner giver forskerne mulighed for at generere tolagede, mosaik organoider. Vi begynder med enzymatisk fordøje fedtvæv, og derefter inkubere mælkefragmenter på en vævskultur parabol for 24 h (Figur 1). Vævsfragmenterne sætter sig på polystyrenretter som tolagede fragmenter med deres in vivo organisation: ydre myoepithelial lag omkring indre luminale lag. Denne cellulære organisation giver mulighed for isolering af de ydre MyoECs ved trypsin-EDTA (0,05%) behandling i 3-6 min efterfulgt af en anden runde af trypsin-EDTA (0,05%) behandling, der løsner de resterende indre LECs (Figur 2). Således er disse celletyper med forskellig trypsin følsomhed isoleret og kan efterfølgende blandes og belagt i ECM (Figur 3). Cellerne gennemgår selvorganisering til at danne tolagede kugler, der omfatter et ydre lag af MyoECs omkring indre LECs. Lumen dannelse opstår som cellerne vokser i et medium, der indeholder en cocktail af vækstfaktorer (se opskrifter på Vækst Medium)13. Efter 5 dage kan organoider differentieres til mælkeproducerende acini ved at skifte til Alveologenesis Medium (se opskrifter og figur 3F)og inkuberes i yderligere 5 dage. Alternativt vil organoider fortsætte med at udvide og filial i Vækst Medium i mindst 10 dage. Organoider kan analyseres ved hjælp af immunfluorescens (figur 3D-F) eller frigives fra ECM ved hjælp af en genvindingsopløsning (se Materialetabel)og analyseres ved hjælp af andre metoder (f.eks. immunblot, RT-qPCR).
Protocol
Representative Results
Discussion
Her præsenteres en metode med detaljer om, hvordan forskere kan generere 3D organoidkulturer ved hjælp af primære MG-celler. Forskellen mellem dette og andre protokoller er, at vi detaljer en metode til at adskille de to, forskellige MG cellerum: den ydre basal MyoECs og indre LECs. Vores metode anvender en to-trins trypsin-EDTA (0,05%) behandling, som vi kalder differentialtrypsinisering19. Denne procedure gør det muligt for forskere at isolere MyoECs og LECs uden at bruge sofistikeret flow c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Ben Abrams for teknisk bistand og kernestøtte fra University of California, Santa Cruz (UCSC) Institute for biologi stamceller (IBSC). Vi takker Susan Strome og Bill Saxton for brugen af deres Solamere Spinning Disk Konfokale mikroskop. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud til UCSC fra Howard Hughes Medical Institute gennem James H. Gilliam Fellowships for Advanced Study program (SR), fra NIH (NIH GM058903) for initiativet til at maksimere de studerendes udvikling (GM) og fra National Science Foundation for et akademisk forskningsstipendium (O.C. DGE 1339067) og ved et tilskud (A18-0370) fra UC-Cancer Research Coordinating Committee (LH).
Materials
| 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352096 | |
| 24 well ultra-low attachment plate (Corning) | Fisher Scientific | CLS3473-24EA | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353001 | |
| 50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon) | Fisher Scientific | 352098 | |
| 60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon) | Fisher Scientific | 353004 | |
| 70 µM nylon cell strainer (Corning) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Pen/Strep also works |
| B27 supplement without vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B6 ACTb-EGFP mice | The Jackson Laboratory | 003291 | |
| BD Insulin syringe 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Class 2 Dispase (Roche) | Millipore Sigma | 4942078001 | |
| Class 3 Collagenase | Worthington Biochemical | LS004206 | |
| Corning Cell Recovery solution | Fisher Scientific | 354253 | Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well | Fisher Scientific | CLS3471 | |
| Dexamethasone | Millipore Sigma | D4902-25MG | |
| DMEM/F12, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11039-021 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington Biochemical | LS002007 | |
| Donkey anti-Goat 647 | Thermo Fisher Scientific | A21447 | Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864 |
| Donkey anti-Mouse 647 | Jackson ImmunoResearch | 715-606-150 | Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Thermo Fisher Scientific | 11330-057 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Without Mg2+/Ca2+ |
| EGF | Fisher Scientific | AF-100-15-100ug | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068–085 | 100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18 |
| Fluoromount-G (Southern Biotech) | Fisher Scientific | 0100-01 | Referred to as mounting media in text |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Goat anti-WAP | Santa Cruz Biotech | SC-14832 | Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601 |
| Hoechst 33342 | AnaSpec | AS-83218 | Use 1:2000, stock is 20mM |
| Insulin | Millipore Sigma | I6634-100mg | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| KRT14–CreERtam | The Jackson Laboratory | 5107 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL | Fisher Scientific | CB-40230C | Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL |
| MillexGV Filter Unit 0.22 µm | Millipore Sigma | SLGV033RS | |
| Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile | Millipore Sigma | PEZGS0816 | These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II). |
| Mouse anti-SMA | Millipore Sigma | A2547 | Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701 |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S671-3 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | S468-500 | |
| Nrg1 | R&D | 5898-NR-050 | |
| Ovine Pituitary Prolactin | National Hormone and Peptide Program | Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute | |
| Paraformaldahyde | Millipore Sigma | PX0055-3 | |
| Pentobarbital | Millipore Sigma | P3761 | |
| R26R-EYFP | The Jackson Laboratory | 6148 | |
| Rho inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
| R-spondin | Peprotech | 120-38 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Sterile Filtered Donkey Serum | Equitech-Bio Inc. | SD30-0500 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | x100-500ML | Laboratory grade |
| Trypsin EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
Referências
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
- Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
- Ip, M. M., Asch, B. B. . Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , (2000).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
- Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
- Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
- Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message?. Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207 (2016).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Biologia do Desenvolvimento. 169 (2), 511-519 (1995).
- Runswick, S. K., O’Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
- Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).
- Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
- Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
- Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).
- Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).
- Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
- Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).
